本文關(guān)鍵詞：貓泛白細(xì)胞減少癥病毒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的建立

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【摘要】：貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus,FPV,FLPV),又稱貓細(xì)小病毒。主要易感動物是貓,故而又稱為貓瘟熱病,也可感染貓以外的多種貓科動物。由于細(xì)小病毒顆粒體積極小,最初并沒有學(xué)者報(bào)道。隨著電鏡及病毒分離技術(shù)廣泛使用,科研者在傳代細(xì)胞和腫瘤組織陸續(xù)分離到細(xì)小病毒。法國人Verge首次發(fā)現(xiàn),1939年正式命名,1985年首次在我國自然感染病例中分離到一株貓細(xì)小病毒,從而證實(shí)貓細(xì)小病毒在我國流行。1986年國內(nèi)文獻(xiàn)首次報(bào)道云豹、非洲幼獅、華南虎均感染了FPV。由此證明:虎、豹、獅等多種珍稀野生動物已經(jīng)嚴(yán)重受到貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的威脅。我國某實(shí)驗(yàn)動物基地2008年從猴傳染性腹瀉病料中分離到一株貓細(xì)小病毒的變異株(BJ-22株),其VP2氨基酸序列與FPV的同源性高達(dá)98.75%,與CPV的同源性為98.15%。可見,FPV宿主感染譜正在不斷擴(kuò)大,已由最初的貓科動物擴(kuò)展至非人靈長類,對社會公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅。本文首先對FPV HH-1/86株細(xì)小病毒理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定,并對其全基因組進(jìn)行測序。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建該株細(xì)小病毒感染性克隆pFPV,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入F81細(xì)胞,成功拯救獲得帶有遺傳標(biāo)記的重組病毒r FPV。為揭示貓細(xì)小病毒高頻率跨物種傳播特征和分子機(jī)制提供反向遺傳學(xué)操作平臺;為貓細(xì)小病毒跨物種傳播預(yù)警和有效防治提供科學(xué)依據(jù)。該株病毒電鏡下可見直徑20nm左右的立體對稱細(xì)小病毒粒子。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí):該病毒在連續(xù)50℃加熱1h、pH3.0作用2h和乙醚作用2h,病毒TCID50升高不到一個(gè)對數(shù),表明病毒對熱、酸、乙醚具有一定的耐受性,pH在5.8~6.8 0.015M PBS均能凝集1%豬紅細(xì)胞,其中pH 6.5血凝活性最佳。該病毒全基因組長5123nt,C+G的含量為36.35%。3’末端反向重復(fù)序列(Inverted Terminal Repeats,ITR)形成Y型結(jié)構(gòu),長126nt;5’末端ITR形成U型結(jié)構(gòu),長198nt。本實(shí)驗(yàn)利用overlap PCR方法,以病毒基因組片段M1、M2、M3為模板,克隆基因組中間大片段M1+M2+M3,經(jīng)凝膠電泳鑒定正確。通過Infusion克隆技術(shù)將中間片段M1+M2+M3插入含3’和5’端質(zhì)粒pE中。體外定點(diǎn)突變:將2981nt由A→G,產(chǎn)生一個(gè)新酶切位點(diǎn)Xho I,構(gòu)建FPV全基因組感染性克隆pFPV。經(jīng)酶切和序列測定證明pFPV正確,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,以Lip3000與質(zhì)粒pFPV按7.5μL:3.5μg比例轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72h,細(xì)胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)、脫落等細(xì)小病毒細(xì)胞病變,將rFPV0三凍三融后按5%同步接毒,第2代后rFPV接毒量降至1%同步接毒,連續(xù)傳代至15代,用于病毒鑒定。通過CPE鑒定、免疫熒光、生長曲線、血凝試驗(yàn)、western blot試驗(yàn),結(jié)果證明,rFPV與親代毒(FPV HH-1/86)病毒學(xué)及生物學(xué)特性沒有明顯差異。本研究為探究貓細(xì)小病毒跨物種傳播關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)、揭示貓細(xì)小病毒高頻率跨物種傳播分子機(jī)理,從而有效防治貓細(xì)小病毒跨物種傳播奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：貓泛白細(xì)胞減少癥病毒 感染性克隆 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 病毒拯救 病毒鑒定
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-23
• 1.1 細(xì)小病毒形態(tài)及理化特征12-13
• 1.2 細(xì)小病毒基因組組成及蛋白功能概述13-16
• 1.2.1 細(xì)小病毒基因組組成13-14
• 1.2.2 細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能14-15
• 1.2.3 細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其功能15-16
• 1.3 細(xì)小病毒滾動式復(fù)制16-17
• 1.4 細(xì)小病毒受體轉(zhuǎn)鐵蛋白17
• 1.5 FPV、MEV和CPV的進(jìn)化概述17-19
• 1.6 病毒反向遺傳學(xué)研究概況19-22
• 1.6.1 反向遺傳學(xué)原理19-20
• 1.6.2 反向遺傳學(xué)應(yīng)用20
• 1.6.3 細(xì)小病毒反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建20-22
• 1.7 研究內(nèi)容及目的意義22-23
• 第二章 FPV HH-1/86株理化性質(zhì)鑒定及全基因組測序23-33
• 2.1 材料與方法23-26
• 2.1.1 毒株23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器23
• 2.1.3 試劑23
• 2.1.4 細(xì)小病毒電鏡觀察23-24
• 2.1.5 病毒理化特性試驗(yàn)24
• 2.1.6 細(xì)小病毒最適pH范圍試驗(yàn)24
• 2.1.7 細(xì)小病毒基因組DNA提取24
• 2.1.8 病毒中間片段擴(kuò)增24-25
• 2.1.9 PCR產(chǎn)物末端加堿基A25-26
• 2.1.10 連接pMD19-T載體26
• 2.1.11 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化26
• 2.1.12 病毒末端ITR擴(kuò)增及連接pMD19-T載體測序26
• 2.2 結(jié)果26-31
• 2.2.1 細(xì)小病毒形態(tài)學(xué)鑒定26-27
• 2.2.2 病毒理化性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果27
• 2.2.3 病毒最適pH范圍試驗(yàn)結(jié)果27-28
• 2.2.4 病毒基因組PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果28-29
• 2.2.5 NS1和VP2氨基酸序列進(jìn)化分析29-30
• 2.2.6 HH-1/86株 3’末端Y和 5’末端U功能分析30-31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 FPV全長質(zhì)粒pFPV構(gòu)建33-39
• 3.1 材料與方法33-36
• 3.1.1 主要試劑33
• 3.1.2 主要儀器33
• 3.1.3 中間片段overlap PCR33-34
• 3.1.4 PCR產(chǎn)物膠回收34-35
• 3.1.5 定點(diǎn)突變35
• 3.1.6 Dpn I產(chǎn)物轉(zhuǎn)化35
• 3.1.7 質(zhì)粒小提35
• 3.1.8 In-fusionTM實(shí)驗(yàn)35-36
• 3.2 結(jié)果36-38
• 3.2.1 overlap PCR電泳結(jié)果36
• 3.2.2 遺傳標(biāo)記鑒定36-37
• 3.2.3 感染性克隆的構(gòu)建與鑒定37-38
• 3.3 討論38-39
• 第四章 rFPV病毒拯救與鑒定39-48
• 4.1 材料與方法39-42
• 4.1.1 試劑39
• 4.1.2 主要儀器39
• 4.1.3 F81細(xì)胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)39
• 4.1.4 F81細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)39-40
• 4.1.5 rFPV病毒培養(yǎng)40
• 4.1.6 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)40
• 4.1.7 FPV多步生長曲線的繪制40
• 4.1.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)40-41
• 4.1.9 遺傳標(biāo)簽酶切鑒定41-42
• 4.1.10 血凝鑒定42
• 4.2 結(jié)果42-47
• 4.2.1 CPE鑒定42-43
• 4.2.2 遺傳標(biāo)記酶切鑒定43-44
• 4.2.3 間接免疫熒光鑒定44-45
• 4.2.4 拯救病毒rFPV增殖特性結(jié)果45-46
• 4.2.5 Western Blot檢測rFPV46
• 4.2.6 血凝鑒定結(jié)果46-47
• 4.3 討論47-48
• 第五章 全文結(jié)論48-49
• 5.1 結(jié)論48
• 5.2 展望48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 作者簡介55-56

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 薛向紅;鄭學(xué)星;蓋微微;梁紅茹;馬金柱;李嶺;王鐵成;馮娜;黃耕;趙永坤;楊松濤;夏咸柱;;狂犬病病毒CVS-11株全序列測定及其感染性克隆的構(gòu)建[J];微生物學(xué)報(bào);2013年04期

2 李平花;白興文;盧增軍;孫普;祁國財(cái);韓成昊;劉在新;;型內(nèi)嵌合口蹄疫病毒全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建[J];微生物學(xué)報(bào);2012年01期

3 靳小霞;孫兆增;曾林;王化磊;王鐵成;楊松濤;夏咸柱;;猴源細(xì)小病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)的優(yōu)化與應(yīng)用[J];中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào);2011年06期

4 呂建亮;張永光;王永錄;潘麗;劉力寬;方玉珍;蔣守田;張維德;;口蹄疫病毒泛亞型O/CHINA/99株全長cDNA分子克隆構(gòu)建和感染性鑒定[J];病毒學(xué)報(bào);2009年01期

5 楊松濤;王立剛;戈銳;劉丹;鄒嘯環(huán);王瑋;王鐵成;周明;馮娜;黃耕;華育平;夏咸柱;;虎源貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的分離鑒定[J];獸類學(xué)報(bào);2007年02期

6 李剛,蔡寶祥,張振興;貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的鑒定[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1985年01期

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本文編號：741905