本文關(guān)鍵詞：鵝Ⅲ型干擾素及其受體的鑒定、組織表達(dá)與免疫學(xué)特性研究

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【摘要】：干擾素(IFNs)是病原微生物入侵,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一類具有抗病毒活性的細(xì)胞因子,屬機(jī)體Ⅱ類細(xì)胞因子,在先天免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。目前,根據(jù)氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特點以及受體特性等,將干擾素分為Ⅲ類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素。Ⅲ型干擾素(IFN-λs)為2003年發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素,其抗病毒作用并不是直接殺傷病毒,而是通過與其特異受體IFNLR1和IL-10R2構(gòu)成的異源二聚體復(fù)合物結(jié)合,激活與Ⅰ型干擾素相似的JAK-STAT信號通路,誘導(dǎo)一系列具有抗病毒作用的干擾素刺激基因(ISGs)。本研究首次克隆獲得鵝Ⅲ型干擾素(goIFNL)及其特異受體(goIFNLR1)的cDNA序列,并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。goIFNL的cDNA序列獲得823 bp,包含一個完整的開放閱讀框,編碼189aa; goIFNLR1序列獲得1952 bp,包含-個完整的開放閱讀框,編碼512 aa。通過NJ法進(jìn)化樹分析,顯示這兩個基因?qū)儆邙B類這一分支,與禽類親緣關(guān)系更為接近。應(yīng)用實時熒光定量PCR方法對goIFNL和goIFNLR1的組織分布情況進(jìn)行探索,結(jié)果顯示goIFNL主要分布在呼吸道組織肺臟(LU)、氣管(TR);胃腸道組織小腸(SI)、肌胃(GI)；皮膚(SK);胰腺(P)及全血(Blood)等上皮細(xì)胞豐盛的組織中,其特異受體goIFNLR1具有相似的組織分布情況。為了解goIFNL的免疫學(xué)特性,選用四種TLR的激動劑及三種禽類相關(guān)病毒分別刺激鵝外周血單.核細(xì)胞建立體外感染細(xì)胞模型,結(jié)果顯示在TLR3的激動劑Poly (I:C)以及TLR9的激動劑ODN2006的刺激下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平得到顯著性的提升。在TLR4的激動劑LPS及TLR7的激動劑R848的刺激下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對照組無顯著性差異。goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在這四種TLR的激動劑的刺激下相較對照組均無顯著性差異。緊接著,我們又探究了鵝重要傳染病的病毒病原對目標(biāo)分子的影響：在小鵝瘟(GPV)病毒的感染下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著性的升高;在低致病性禽流感病母(H9N2 AIV)及鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的感染下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對照組無顯著性差異,而goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在這三種病毒的刺激下均無顯著性差異。同時,選用這三種禽類病毒人工感染雛鵝建立體內(nèi)動物模型,經(jīng)qRT-PCR檢測goIFNL及goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示在H9N2AIV的感染下,goIFNL的表達(dá)量相較對照組在肺臟組織(LU)中有近20倍的提升,在胰腺組織(P)中有近40倍的提升。而在其他兩種病毒的感染下,goIFNL及goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對照組無顯著性差異。以上結(jié)果表明goIFNL在鵝的抗病毒固有免疫中扮演著一定的角色。為進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能,選擇對goIFNL進(jìn)行原核和真核表達(dá),分別構(gòu)建pET-32a-goIFNL原核表達(dá)載體及pcDNA3.1-goIFNL真核表達(dá)載體。構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒以IPTG終濃度0.8mM誘導(dǎo)3h的條件在大腸桿菌BL21 (DE3)中被成功誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)的融合蛋白以包涵體形式存在。利用Ni-NTA親和層析純化重組goIFNL融合蛋白,并以此為免疫原制備鼠抗goIFNL多克隆抗體。經(jīng)Western-Blot驗證,真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-goIFNL能在BHK21細(xì)胞中表達(dá)goIFNL蛋白,這為goIFNL抗病毒免疫學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。綜上,本研究成功克隆了goIFNL及goIFNLRl基因,并對其在鵝的組織分布及其免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步研究,goIFNL的原核表達(dá)及真核表達(dá)為后續(xù)進(jìn)行生物學(xué)活性的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鵝Ⅲ型干擾素(goIFNL) 鵝Ⅲ型干擾素受體(goIFNLR1) 分子克隆 組織表達(dá)譜 免疫學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S835
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-19
• 1 干擾素簡介11
• 2 干擾素的分類和特點11-17
• 2.1 Ⅲ型干擾素基因結(jié)構(gòu)12
• 2.2 IFN-λs的信號通路12-14
• 2.3 IFN-λs的生物學(xué)活性14-17
• 3 禽類Ⅲ型干擾素研究進(jìn)展17
• 4 本研究的目的及意義17-19
• 第二章 鵝Ⅲ型干擾素及其受體的克隆及組織分布研究19-32
• 1 實驗材料19-20
• 1.1 實驗動物19
• 1.2 主要試劑19-20
• 1.3 主要儀器和設(shè)備20
• 1.4 相關(guān)溶液的配制20
• 2 實驗方法與操作20-28
• 2.1 總RNA的抽提及純度檢測20-21
• 2.2 第一鏈cDNA的合成21
• 2.3 goIFNL及goIFNLR1保守片段的擴(kuò)增和鑒定21-24
• 2.4 goIFNL及goIFNLR1 cDNA末端快速擴(kuò)增24-25
• 2.5 goIFNL和goIFNLR1 cDNA全長序列的獲得25-26
• 2.6 goIFNL和goIFNLR1的組織表達(dá)譜構(gòu)建26-27
• 2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析27-28
• 3 實驗結(jié)果28-31
• 3.1 goIFNL和goIFNLRl基因的克隆28
• 3.2 goIFNL的組織表達(dá)譜28-29
• 3.3 goIFNLRl的組織表達(dá)譜29-31
• 4 討論31-32
• 第三章 生物信息學(xué)相關(guān)分析32-43
• 1 實驗結(jié)果32-41
• 1.1 goIFNL和goIFNLR1開放閱讀框序列分析32-36
• 1.2 goIFNL二級結(jié)構(gòu)預(yù)測36-37
• 1.3 goIFNL和goIFNLR1開放閱讀框的多序列比對分析37-39
• 1.4 goIFNL和goIFNLR1氨基酸序列的進(jìn)化樹分析39-41
• 2 討論41-43
• 第四章 鵝Ⅲ型干擾素的免疫學(xué)特性研究43-52
• 1 實驗材料44-45
• 1.1 實驗動物及毒株44
• 1.2 主要試劑44
• 1.3 主要儀器和設(shè)備44-45
• 2 實驗方法與操作45-47
• 2.1 鵝外周血單核細(xì)胞的分離45
• 2.2 免疫刺激劑和病毒處理外周血單核細(xì)胞45-46
• 2.3 體內(nèi)感染實驗46
• 2.4 免疫應(yīng)答檢測46-47
• 3 實驗結(jié)果47-50
• 3.1 免疫刺激劑處理鵝外周血單核細(xì)胞47-48
• 3.2 病毒刺激鵝外周血單核細(xì)胞48-49
• 3.3 病毒體內(nèi)感染動物模型49-50
• 4 討論50-52
• 第五章 鵝Ⅲ型干擾素的體外重組表達(dá)52-76
• 1 實驗材料52-57
• 1.1 實驗試劑耗材52-53
• 1.2 主要儀器和設(shè)備53
• 1.3 菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞和實驗動物53
• 1.4 相關(guān)溶液的配制53-57
• 2 實驗方法57-67
• 2.1 goIFNL的原核表達(dá)57-62
• 2.2 goIFNL多克隆抗體制備62-63
• 2.3 goIFNL的真核表達(dá)63-67
• 3 實驗結(jié)果67-74
• 3.1 PCR擴(kuò)增goIFNL目的片段67-68
• 3.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建68-71
• 3.3 優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pET-32a-goIFNL重組質(zhì)粒71
• 3.4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化71-72
• 3.5 goIFNL的真核表達(dá)72-74
• 4 討論74-76
• 全文小結(jié)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 致謝82-83
• 作者簡介及發(fā)表論文情況83

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