本文關(guān)鍵詞：IL-2基因佐劑對(duì)羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果的影響研究

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【摘要】：羊口瘡病毒(Orf virus,Orf V)屬于痘病毒科、副痘病毒屬成員,為有囊膜線性雙股DNA病毒,是引起綿羊、山羊發(fā)生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚、黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍以及結(jié)成疣狀厚痂為主要特征的接觸性、嗜上皮性、人獸共患傳染病病原。羊口瘡在養(yǎng)羊的國(guó)家和地區(qū)普遍發(fā)生,常呈群發(fā)性流行,是嚴(yán)重威脅養(yǎng)羊業(yè)、具有重要經(jīng)濟(jì)意義的病毒病。疫苗接種是防控病毒性疫病可靠且有效的手段,Orf常用疫苗有弱毒、滅活疫苗,但在生產(chǎn)實(shí)踐中羊口瘡弱毒苗存在散毒危險(xiǎn)、毒力返強(qiáng)等缺陷,滅活苗存在滅活不徹底、產(chǎn)生抗體水平較低等缺陷。因此,運(yùn)用基因工程技術(shù)開發(fā)Orf新型疫苗具有重要意義。Orf V誘導(dǎo)機(jī)體以細(xì)胞免疫為主,而IL-2是Th1型細(xì)胞因子,可作為細(xì)胞因子免疫佐劑,與核酸疫苗聯(lián)用能增強(qiáng)其免疫效果。本研究構(gòu)建了山羊IL-2基因、Orf V B2L基因和F1L基因三種真核表達(dá)質(zhì)粒,將山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒作為細(xì)胞因子佐劑與Orf V真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠,探討山羊IL-2細(xì)胞因子佐劑對(duì)Orf V核酸疫苗免疫效果的影響研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá):采集健康貴州黑山羊外周血,分離培養(yǎng)淋巴細(xì)胞,提取淋巴細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定獲得山羊IL-2基因序列,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;以p VAX1為真核表達(dá)載體,構(gòu)建山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒,采用質(zhì)粒PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞,采用RT-PCR和ELISA方法對(duì)其轉(zhuǎn)錄、瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,貴州黑山羊IL-2基因完整編碼閱讀框長(zhǎng)468 bp,編碼155個(gè)氨基酸,與Gen Bank中羊源IL-2基因序列相比,核苷酸序列一致性為95.9%-100%,氨基酸序列一致性為91.1%-100%;將羊IL-2基因序列提交Gen Bank,獲得登錄號(hào)KT934548;生物信息學(xué)預(yù)測(cè),該蛋白α-螺旋與β-折疊較多,有信號(hào)肽,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和特定功能結(jié)構(gòu)域,整條肽鏈表現(xiàn)為親水性;經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒p VAX1-IL-2;p VAX1-IL-2轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞48 h后的上清,RT-PCR檢測(cè)到IL-2基因的m RNA轉(zhuǎn)錄,ELISA方法檢測(cè)到MDBK細(xì)胞上清IL-2蛋白濃度約為112 pg/m L。2.羊口瘡病毒B2L、F1L基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá):根據(jù)Gen Bank收錄的Orf V基因序列(No.AY386264),分別設(shè)計(jì)針對(duì)Orf V B2L、F1L基因引物,通過PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定獲得B2L、F1L基因序列,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;以p VAX1為真核表達(dá)載體,構(gòu)建B2L、F1L基因真核表達(dá)質(zhì)粒,采用質(zhì)粒PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞,采用RT-PCR和IFA方法對(duì)其轉(zhuǎn)錄、瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,Orf V-GZ株B2L基因全長(zhǎng)1137 bp,與Gen Bank中B2L基因序列相比,其核苷酸序列一致性為97.3%-98.8%,氨基酸序列一致性為97.1%-99.7%;F1L基因全長(zhǎng)1029 bp,,與Gen Bank中F1L基因序列相比,其核苷酸序列一致性為96.0%-99.6%,氨基酸序列一致性為95.5%-99.7%;分別將Orf V-GZ株B2L、F1L基因提交Gen Bank,獲得登錄號(hào)KP994595、KP057582;生物信息學(xué)分析,B2L基因編碼蛋白α-螺旋和β-折疊較多,整條肽鏈表現(xiàn)為疏水性,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽,含2個(gè)磷脂酶D超家族保守結(jié)構(gòu)域,同時(shí)還有相應(yīng)的特異性結(jié)合位點(diǎn);F1L基因編碼蛋白α-螺旋和β-折疊較多,整條肽鏈表現(xiàn)為疏水性,含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),無(wú)信號(hào)肽。經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒p VAX1-B2L、p VAX1-F1L;RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有B2L、F1L基因m RNA轉(zhuǎn)錄,IFA方法檢測(cè)到B2L、F1L基因在MDBK細(xì)胞中表達(dá)。3.IL-2基因佐劑對(duì)羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果影響研究:以p VAX1-IL-2作為細(xì)胞因子佐劑,分別與p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L聯(lián)合免疫小鼠,采用ELISA方法對(duì)小鼠血清中Orf V特異性抗體與Th1型(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定;MTT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況;FACS法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群變化。結(jié)果表明,p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L三組質(zhì)粒均具有良好免疫原性,各真核質(zhì)粒免疫組1周后均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Orf V特異性抗體,第6周時(shí)抗體水平最高,第7周時(shí)抗體水平開始下降,其中以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫組抗體變化趨勢(shì)明顯;MTT法檢測(cè)結(jié)果表明三組質(zhì)粒誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均高于p VAX1和PBS組,差異極顯著(P0.01),加入p VAX1-IL-2佐劑組與未加入佐劑組相比,差異極顯著(P0.01),表明p VAX1-IL-2對(duì)三組質(zhì)粒誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用,在1~4周能夠持續(xù)增殖;FACS結(jié)果表明p VAX1-B2L、p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-IL-2、p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫組的CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞含量較PBS組與p VAX1組高,以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫組最高,且加p VAX1-IL-2細(xì)胞因子佐劑組高于未加佐劑組,CD4+T細(xì)胞含量高于CD8+T細(xì)胞含量,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值介于1.71~2.94之間,表明各真核質(zhì)粒免疫組均能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞亞類增殖,輔助性T細(xì)胞高于抑制性T細(xì)胞,重組質(zhì)粒不會(huì)引起小鼠不良反應(yīng);細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明,Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)含量高于Th2型(IL-4、IL6、IL-10),且加入p VAX1-IL-2佐劑組高于未加佐劑組,表明細(xì)胞免疫以Th1型為主。結(jié)論:本試驗(yàn)成功克隆了貴州黑山羊IL-2基因,Orf V-GZ株B2L基因和F1L基因,生物信息學(xué)分析表明三個(gè)基因具有良好抗原性。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了三種真核表達(dá)質(zhì)粒p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L和p VAX1-F1L。p VAX1-IL-2對(duì)p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的Orf V特異性體液免疫和細(xì)胞免疫具一定的促進(jìn)作用,細(xì)胞免疫應(yīng)答以Th1型為主。
【關(guān)鍵詞】：IL-2 基因佐劑 羊口瘡病毒 核酸疫苗 免疫效果
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)綜述115-24
• 文獻(xiàn)綜述224-32
• 第一章 山羊IL-2 基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)研究32-55
• 1 材料32-33
• 1.1 主要材料32
• 1.2 主要試劑32
• 1.3 主要儀器32-33
• 2 方法33-43
• 2.1 山羊IL-2 基因克隆與序列分析33-39
• 2.2 山羊IL-2 基因生物信息學(xué)分析39
• 2.3 山羊IL-2 基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)39-43
• 3 結(jié)果43-52
• 3.1 山羊IL-2 基因克隆及序列分析結(jié)果43-47
• 3.2 山羊IL-2 基因生物信息學(xué)分析結(jié)果47-50
• 3.3 山羊IL-2 基因真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果50-52
• 4 討論52-54
• 4.1 關(guān)于山羊IL-2 基因克隆及生物信息學(xué)分析52-53
• 4.2 關(guān)于真核表達(dá)質(zhì)粒載體的選擇53
• 4.3 關(guān)于pVAX1-IL-2 在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)53-54
• 5 小結(jié)54-55
• 第二章 羊口瘡病毒(OrfV) B2L、F1L基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)研究55-80
• 1 材料55-56
• 1.1 主要材料55-56
• 1.2 主要試劑56
• 1.3 主要儀器56
• 2 方法56-60
• 2.1 OrfV B2L、F1L基因克隆與序列分析56-58
• 2.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息學(xué)分析58
• 2.3 OrfV B2L、F1L基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)58-60
• 3 結(jié)果60-77
• 3.1 OrfV B2L、F1L基因的克隆及序列分析結(jié)果60-67
• 3.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果67-74
• 3.3 OrfV B2L、F1L基因真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果74-77
• 4 討論77-79
• 4.1 關(guān)于OrfV核酸疫苗目的基因的選擇77
• 4.2 關(guān)于OrfV B2L與F1L基因的生物信息學(xué)分析77-78
• 4.3 關(guān)于OrfV pVAX1-B2L和pVAX1-F1L在MDBK細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)78-79
• 5 小結(jié)79-80
• 第三章 IL- 2 基因佐劑對(duì)羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果的影響研究80-122
• 1 材料81
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物81
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料81
• 1.3 主要試劑81
• 1.4 主要儀器81
• 2 方法81-86
• 2.1 pVAX1-IL-2、pVAX1-B2L和pVAX1-F1L質(zhì)粒制備81-82
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(KM系)免疫試驗(yàn)82-83
• 2.3 免疫小鼠血清中特異性抗體水平檢測(cè)83
• 2.4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)83-84
• 2.5 免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞類變化84-85
• 2.6 免疫小鼠血清中Th1/ Th2型細(xì)胞因子檢測(cè)85-86
• 3 結(jié)果86-116
• 3.1 免疫小鼠血清中特異性抗體水平動(dòng)態(tài)變化結(jié)果86-90
• 3.2 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果90-94
• 3.3 免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞類分析結(jié)果94-97
• 3.4 免疫小鼠血清中Th1/Th2型細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果97-116
• 4 討論116-121
• 4.1 關(guān)于IL-2 基因佐劑對(duì)核酸疫苗免疫效果的影響116-118
• 4.2 關(guān)于OrfV核酸疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)118-120
• 4.3 關(guān)于免疫檢測(cè)指標(biāo)的選擇120-121
• 5 小結(jié)121-122
• 全文結(jié)論122-123
• 參考文獻(xiàn)123-129
• 附錄一 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況129-130
• 附錄二 攻讀碩士期間取得的成果130-136
• 附錄三 主要培養(yǎng)基、溶液及試劑配制136-137
• 致謝137-138

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本文編號(hào)：702663