本文關鍵詞：IL-2基因佐劑對羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果的影響研究

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【摘要】：羊口瘡病毒(Orf virus,Orf V)屬于痘病毒科、副痘病毒屬成員,為有囊膜線性雙股DNA病毒,是引起綿羊、山羊發(fā)生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚、黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍以及結成疣狀厚痂為主要特征的接觸性、嗜上皮性、人獸共患傳染病病原。羊口瘡在養(yǎng)羊的國家和地區(qū)普遍發(fā)生,常呈群發(fā)性流行,是嚴重威脅養(yǎng)羊業(yè)、具有重要經(jīng)濟意義的病毒病。疫苗接種是防控病毒性疫病可靠且有效的手段,Orf常用疫苗有弱毒、滅活疫苗,但在生產(chǎn)實踐中羊口瘡弱毒苗存在散毒危險、毒力返強等缺陷,滅活苗存在滅活不徹底、產(chǎn)生抗體水平較低等缺陷。因此,運用基因工程技術開發(fā)Orf新型疫苗具有重要意義。Orf V誘導機體以細胞免疫為主,而IL-2是Th1型細胞因子,可作為細胞因子免疫佐劑,與核酸疫苗聯(lián)用能增強其免疫效果。本研究構建了山羊IL-2基因、Orf V B2L基因和F1L基因三種真核表達質(zhì)粒,將山羊IL-2基因真核表達質(zhì)粒作為細胞因子佐劑與Orf V真核表達質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠,探討山羊IL-2細胞因子佐劑對Orf V核酸疫苗免疫效果的影響研究。主要研究內(nèi)容如下:1.山羊IL-2基因真核表達質(zhì)粒構建及其在MDBK細胞中的表達:采集健康貴州黑山羊外周血,分離培養(yǎng)淋巴細胞,提取淋巴細胞總RNA,通過RT-PCR擴增、序列測定獲得山羊IL-2基因序列,并對其進行生物信息學分析;以p VAX1為真核表達載體,構建山羊IL-2基因真核表達質(zhì)粒,采用質(zhì)粒PCR、雙酶切和測序鑒定;將重組質(zhì)粒轉染MDBK細胞,采用RT-PCR和ELISA方法對其轉錄、瞬時表達進行鑒定。結果表明,貴州黑山羊IL-2基因完整編碼閱讀框長468 bp,編碼155個氨基酸,與Gen Bank中羊源IL-2基因序列相比,核苷酸序列一致性為95.9%-100%,氨基酸序列一致性為91.1%-100%;將羊IL-2基因序列提交Gen Bank,獲得登錄號KT934548;生物信息學預測,該蛋白α-螺旋與β-折疊較多,有信號肽,無跨膜結構和特定功能結構域,整條肽鏈表現(xiàn)為親水性;經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切和測序鑒定,成功構建了真核表達質(zhì)粒p VAX1-IL-2;p VAX1-IL-2轉染MDBK細胞48 h后的上清,RT-PCR檢測到IL-2基因的m RNA轉錄,ELISA方法檢測到MDBK細胞上清IL-2蛋白濃度約為112 pg/m L。2.羊口瘡病毒B2L、F1L基因真核表達質(zhì)粒構建及其在MDBK細胞中的表達:根據(jù)Gen Bank收錄的Orf V基因序列(No.AY386264),分別設計針對Orf V B2L、F1L基因引物,通過PCR擴增、序列測定獲得B2L、F1L基因序列,并對其進行生物信息學分析;以p VAX1為真核表達載體,構建B2L、F1L基因真核表達質(zhì)粒,采用質(zhì)粒PCR、雙酶切和測序鑒定;將重組質(zhì)粒轉染MDBK細胞,采用RT-PCR和IFA方法對其轉錄、瞬時表達進行鑒定。結果表明,Orf V-GZ株B2L基因全長1137 bp,與Gen Bank中B2L基因序列相比,其核苷酸序列一致性為97.3%-98.8%,氨基酸序列一致性為97.1%-99.7%;F1L基因全長1029 bp,,與Gen Bank中F1L基因序列相比,其核苷酸序列一致性為96.0%-99.6%,氨基酸序列一致性為95.5%-99.7%;分別將Orf V-GZ株B2L、F1L基因提交Gen Bank,獲得登錄號KP994595、KP057582;生物信息學分析,B2L基因編碼蛋白α-螺旋和β-折疊較多,整條肽鏈表現(xiàn)為疏水性,無跨膜結構和信號肽,含2個磷脂酶D超家族保守結構域,同時還有相應的特異性結合位點;F1L基因編碼蛋白α-螺旋和β-折疊較多,整條肽鏈表現(xiàn)為疏水性,含2個跨膜結構,無信號肽。經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切和測序鑒定,成功構建真核表達質(zhì)粒p VAX1-B2L、p VAX1-F1L;RT-PCR方法檢測轉染細胞中有B2L、F1L基因m RNA轉錄,IFA方法檢測到B2L、F1L基因在MDBK細胞中表達。3.IL-2基因佐劑對羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果影響研究:以p VAX1-IL-2作為細胞因子佐劑,分別與p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L聯(lián)合免疫小鼠,采用ELISA方法對小鼠血清中Orf V特異性抗體與Th1型(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)細胞因子進行測定;MTT法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖情況;FACS法檢測小鼠脾淋巴細胞亞群變化。結果表明,p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L三組質(zhì)粒均具有良好免疫原性,各真核質(zhì)粒免疫組1周后均能誘導小鼠產(chǎn)生Orf V特異性抗體,第6周時抗體水平最高,第7周時抗體水平開始下降,其中以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫組抗體變化趨勢明顯;MTT法檢測結果表明三組質(zhì)粒誘導的淋巴細胞增殖反應均高于p VAX1和PBS組,差異極顯著(P0.01),加入p VAX1-IL-2佐劑組與未加入佐劑組相比,差異極顯著(P0.01),表明p VAX1-IL-2對三組質(zhì)粒誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖具有促進作用,在1~4周能夠持續(xù)增殖;FACS結果表明p VAX1-B2L、p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-IL-2、p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫組的CD3+CD4+T淋巴細胞含量較PBS組與p VAX1組高,以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫組最高,且加p VAX1-IL-2細胞因子佐劑組高于未加佐劑組,CD4+T細胞含量高于CD8+T細胞含量,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細胞比值介于1.71~2.94之間,表明各真核質(zhì)粒免疫組均能誘導淋巴細胞亞類增殖,輔助性T細胞高于抑制性T細胞,重組質(zhì)粒不會引起小鼠不良反應;細胞因子檢測結果表明,Th1型細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)含量高于Th2型(IL-4、IL6、IL-10),且加入p VAX1-IL-2佐劑組高于未加佐劑組,表明細胞免疫以Th1型為主。結論:本試驗成功克隆了貴州黑山羊IL-2基因,Orf V-GZ株B2L基因和F1L基因,生物信息學分析表明三個基因具有良好抗原性。本實驗構建了三種真核表達質(zhì)粒p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L和p VAX1-F1L。p VAX1-IL-2對p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L在小鼠體內(nèi)誘導的Orf V特異性體液免疫和細胞免疫具一定的促進作用,細胞免疫應答以Th1型為主。
【關鍵詞】：IL-2 基因佐劑 羊口瘡病毒 核酸疫苗 免疫效果
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 前言14-15
• 文獻綜述115-24
• 文獻綜述224-32
• 第一章 山羊IL-2 基因真核表達質(zhì)粒構建及其在MDBK細胞中的表達研究32-55
• 1 材料32-33
• 1.1 主要材料32
• 1.2 主要試劑32
• 1.3 主要儀器32-33
• 2 方法33-43
• 2.1 山羊IL-2 基因克隆與序列分析33-39
• 2.2 山羊IL-2 基因生物信息學分析39
• 2.3 山羊IL-2 基因真核表達質(zhì)粒構建與表達39-43
• 3 結果43-52
• 3.1 山羊IL-2 基因克隆及序列分析結果43-47
• 3.2 山羊IL-2 基因生物信息學分析結果47-50
• 3.3 山羊IL-2 基因真核表達質(zhì)粒鑒定結果50-52
• 4 討論52-54
• 4.1 關于山羊IL-2 基因克隆及生物信息學分析52-53
• 4.2 關于真核表達質(zhì)粒載體的選擇53
• 4.3 關于pVAX1-IL-2 在MDBK細胞中的表達53-54
• 5 小結54-55
• 第二章 羊口瘡病毒(OrfV) B2L、F1L基因真核表達質(zhì)粒的構建與表達研究55-80
• 1 材料55-56
• 1.1 主要材料55-56
• 1.2 主要試劑56
• 1.3 主要儀器56
• 2 方法56-60
• 2.1 OrfV B2L、F1L基因克隆與序列分析56-58
• 2.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息學分析58
• 2.3 OrfV B2L、F1L基因真核表達質(zhì)粒構建與表達58-60
• 3 結果60-77
• 3.1 OrfV B2L、F1L基因的克隆及序列分析結果60-67
• 3.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息學分析結果67-74
• 3.3 OrfV B2L、F1L基因真核表達質(zhì)粒鑒定結果74-77
• 4 討論77-79
• 4.1 關于OrfV核酸疫苗目的基因的選擇77
• 4.2 關于OrfV B2L與F1L基因的生物信息學分析77-78
• 4.3 關于OrfV pVAX1-B2L和pVAX1-F1L在MDBK細胞中的轉錄和表達78-79
• 5 小結79-80
• 第三章 IL- 2 基因佐劑對羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果的影響研究80-122
• 1 材料81
• 1.1 實驗動物81
• 1.2 實驗材料81
• 1.3 主要試劑81
• 1.4 主要儀器81
• 2 方法81-86
• 2.1 pVAX1-IL-2、pVAX1-B2L和pVAX1-F1L質(zhì)粒制備81-82
• 2.2 實驗動物(KM系)免疫試驗82-83
• 2.3 免疫小鼠血清中特異性抗體水平檢測83
• 2.4 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖試驗83-84
• 2.5 免疫小鼠脾臟T淋巴細胞亞類變化84-85
• 2.6 免疫小鼠血清中Th1/ Th2型細胞因子檢測85-86
• 3 結果86-116
• 3.1 免疫小鼠血清中特異性抗體水平動態(tài)變化結果86-90
• 3.2 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結果90-94
• 3.3 免疫小鼠脾臟T淋巴細胞亞類分析結果94-97
• 3.4 免疫小鼠血清中Th1/Th2型細胞因子檢測結果97-116
• 4 討論116-121
• 4.1 關于IL-2 基因佐劑對核酸疫苗免疫效果的影響116-118
• 4.2 關于OrfV核酸疫苗誘導免疫反應118-120
• 4.3 關于免疫檢測指標的選擇120-121
• 5 小結121-122
• 全文結論122-123
• 參考文獻123-129
• 附錄一 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況129-130
• 附錄二 攻讀碩士期間取得的成果130-136
• 附錄三 主要培養(yǎng)基、溶液及試劑配制136-137
• 致謝137-138

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本文編號：702663