本文關鍵詞：基于密碼子優(yōu)化的VP1基因表達蛋白檢測1型和3型鴨甲肝病毒抗體的膠體金試紙條

  更多相關文章： DHAV-1和DHAV-3 密碼子優(yōu)化的VP1蛋白 膠體金免疫層析試紙條

【摘要】：鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)引起的鴨病毒性肝炎主要侵害3周齡以下雛鴨,死亡率高達90%以上。VP1蛋白位于DHAV衣殼表面,是其主要的結構蛋白之一,也是病毒粒子抗原性的主要組成部分。已有研究資料表明,1型和3型鴨甲肝病毒(DHAV-1和DHAV-3)存在抗原交叉,為建立簡單快速的檢測DHAV-1和DHAV-3抗體的方法,本研究對DHAV-1 X株的結構蛋白VP1基因進行密碼子優(yōu)化后克隆到pET-28a(+)載體中,構建重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)/optiVP1并進行原核表達,純化表達蛋白,開展了基于密碼子優(yōu)化型VP1重組蛋白的檢測DHAV-1和DHAV-3抗體的膠體金免疫層析試紙條的研制等一系列研究,主要結果如下：1. DHAV-1 VP1基因稀有密碼子及抗原表位分析通過生物信息學在線網(wǎng)站分析1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)X株VP1基因稀有密碼子情況和抗原表位,發(fā)現(xiàn)VP1中含26個稀有密碼子,稀有密碼子含量較多,且存在五處連續(xù)稀有密碼子,1-72位氨基酸序列和83-238位氨基酸序抗原表位較豐富。并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性對VP1密碼子進行改造,人工合成密碼子優(yōu)化型VP1 (optiVP1)基因。2.VP1和optiVP1基因克隆表達、鑒定及純化通過RT-PCR擴增了預期大小的DHAV-1-X VP1全基因序列,將目的片段VP1和optiVP1分別克隆至pET-28a(+)上,構建兩種原核表達質(zhì)粒pET-28a (+)/VP1和pET-28a (+)/optiVP1并轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中進行原核表達。結果表明,只有optiVPl成功表達,在0.4 mmol/LIPTG、37℃誘導12h的表達量最大,表達的重組蛋白大小約為32 kDa,以包涵體的形式存在。采用切膠回收方法獲得純度較高的重組蛋白,Western blot分析結果表明該蛋白可被兔抗DHAV-1抗體和兔抗DHAV-3抗體識別,具有良好的反應原性。3. optiVPl多克隆抗體的制備用純化的optiVP1蛋白免疫昆明鼠,制備的鼠抗optiVP1高免血清的間接ELISA效價達到1：51200,間接免疫熒光試驗證實該鼠抗optiVP1血清能識別DHAV-1和DHAV-3,表明optiVP1具有良好的免疫原性。4. 檢測DHAV抗體的金標試紙條的研制及應用以optiVP1蛋白為抗原制備了雙抗原夾心法(ICS-SM)和間接法(ICS-ID)檢測DHAV抗體的膠體金免疫層析試紙條,特異性試驗結果表明制備的金標試紙條能夠檢測DHAV-1抗體和DHAV-3抗體,對鴨疫里默氏菌(RA)、鴨瘟、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌等鴨常見病的陽性血清檢測結果為陰性,特異性好。敏感性試驗結果表明,當DHAV-1陽性血清作1：64稀釋時,檢測結果仍呈陽性；當DHAV-3陽性血清作1：32稀釋時,檢測結果仍呈陽性。對16份臨床鴨血清樣本的檢測限度結果表明雙抗原夾心法試紙條的靈敏度與中和試驗相當甚至高于中和試驗,間接法試紙條敏感性與中和試驗相當。雙抗原夾心法試紙條和間接法試紙條與間接ELISA方法檢測結果的符合率分別為82.3%(93/113)和85.8%(97/113),與中和試驗的符合率均為100%(16/16)。制備的雙抗原夾心法試紙條和間接法試紙條穩(wěn)定性好,可在4℃至少保存6個月。
【關鍵詞】：DHAV-1和DHAV-3 密碼子優(yōu)化的VP1蛋白 膠體金免疫層析試紙條
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 部分縮寫詞及符號說明表7-12
• 一、文獻綜述12-19
• 1 鴨甲肝病毒(DHAV)概述12-13
• 1.1 DHAV的病原學特性12
• 1.2 DHAV的分子生物學特征12-13
• 2 DHAV VP1基因及VP1蛋白的研究進展13-14
• 3 鴨甲肝病毒病原和抗體的診斷方法14-16
• 3.1 根據(jù)臨床癥狀和病理剖檢病變診斷14-15
• 3.2 血清學診斷15-16
• 3.3 分子生物學診斷16
• 4 免疫膠體金技術16-18
• 4.1 基本原理17
• 4.2 應用及發(fā)展前景17-18
• 5 選題目的及意義18-19
• 二、試驗研究19-57
• 1 材料19-22
• 1.1 毒株、菌種、血清和試驗動物19
• 1.2 主要試劑19-20
• 1.3 其他試驗材料20
• 1.4 常用試劑的配制20-22
• 2 主要儀器設備22
• 3 試驗方法22-33
• 3.1 VP1基因和optiVP1的克隆、表達及純化22-27
• 3.1.1 VP1密碼子偏嗜性及抗原表位分析22
• 3.1.2 VP1密碼子優(yōu)化及基因合成22-23
• 3.1.3 引物設計23
• 3.1.4 病毒總RNA的提取23
• 3.1.5 VP1基因的RT-PCR擴增23-24
• 3.1.6 VP1基因的T克隆24
• 3.1.7 原核重組表達質(zhì)粒的構建24-25
• 3.1.8 目的蛋白的表達及純化25-27
• 3.2 鼠抗optiVP1蛋白血清的制備及應用27-28
• 3.2.1 鼠抗重組蛋白高免血清的制備27
• 3.2.2 基于鼠抗optiVP1血清的間接免疫熒光檢測DHAV-1和DHAV-327-28
• 3.3 膠體金免疫層析試紙條的研制28-31
• 3.3.1 抗原夾心法試紙條的研制28-30
• 3.3.2 間接法試紙條的研制30
• 3.3.3 試紙條性能評估30-31
• 3.4 間接ELISA檢測DHAV抗體31-32
• 3.4.1 DHAV-1的增殖及純化31
• 3.4.2 間接ELISA檢測DHAV抗體31-32
• 3.4.3 臨界值的確定32
• 3.4.4 特異性試驗32
• 3.4.5 間接ELISA與金標試紙條符合率的評估32
• 3.5 中和試驗檢測DHAV抗體32-33
• 3.5.1 病毒TCID_(50)的測定32-33
• 3.5.2 中和效價的測定33
• 3.5.3 中和試驗與金標試紙條靈敏度和符合率的比較33
• 4 試驗結果33-57
• 4.1 VP1密碼子偏嗜性分析及VP1密碼子優(yōu)化33-35
• 4.1.1 VP1密碼子偏嗜性及抗原表位分析33-34
• 4.1.2 VP1密碼子優(yōu)化34-35
• 4.2 VP1和optiVP1的克隆表達、鑒定及純化35-40
• 4.2.1 VP1的PCR擴增35-36
• 4.2.2 VP1基因的T克隆36-37
• 4.2.3 VP1和optiVP1基因的亞克隆37
• 4.2.4 重組蛋白的表達37-39
• 4.2.5 重組蛋白optiVP1的純化39-40
• 4.3 鼠抗optiVP1蛋白血清的制備及運用40-41
• 4.3.1 鼠抗optiVP1蛋白血清效價的測定40
• 4.3.2 基于鼠抗optiVP1抗體的間接免疫熒光檢測DHAV-1和DHAV-340-41
• 4.4 膠體金免疫層析試紙條的研制41-51
• 4.4.1 雙抗原夾心法試紙條的研制41-46
• 4.4.2 間接法試紙條的研制46-47
• 4.4.3 試紙條性能評價47-51
• 4.5 間接ELISA檢測DHAV抗體51-55
• 4.5.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的摸索51-52
• 4.5.2 酶標二抗的最佳稀釋度52-53
• 4.5.3 抗原的包被條件的優(yōu)化53
• 4.5.4 臨界值的確定53-54
• 4.5.5 特異性試驗54
• 4.5.6 膠體金試紙條和間接ELISA符合率的評估54-55
• 4.6 中和試驗檢測DHAV抗體55-57
• 4.6.1 病毒TCID_(50)的測定55-56
• 4.6.2 中和效價的測定56
• 4.6.3 中和試驗與金標試紙條靈敏度和符合率的比較56-57
• 三、討論57-62
• 1 optiVP1蛋白的原核表達、純化及活性分析57-58
• 2 雙抗原夾心法與間接法試紙條檢測DHAV抗體的優(yōu)缺點58-59
• 3 試紙條的保存及耗材的篩選59
• 4 基于optiVP1蛋白的膠體金試紙條的研制59-62
• 四、結論62-63
• 參考文獻63-70
• 致謝70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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7 陳曉娟;閆少春;邵國;;蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J];包頭醫(yī)學院學報;2014年03期

8 時建立;戰(zhàn)翔;李俊;叢曉燕;孫文博;杜以軍;彭U，

本文編號：686694