本文關(guān)鍵詞：基于密碼子優(yōu)化的VP1基因表達(dá)蛋白檢測(cè)1型和3型鴨甲肝病毒抗體的膠體金試紙條

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【摘要】：鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)引起的鴨病毒性肝炎主要侵害3周齡以下雛鴨,死亡率高達(dá)90%以上。VP1蛋白位于DHAV衣殼表面,是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,也是病毒粒子抗原性的主要組成部分。已有研究資料表明,1型和3型鴨甲肝病毒(DHAV-1和DHAV-3)存在抗原交叉,為建立簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3抗體的方法,本研究對(duì)DHAV-1 X株的結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后克隆到pET-28a(+)載體中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/optiVP1并進(jìn)行原核表達(dá),純化表達(dá)蛋白,開(kāi)展了基于密碼子優(yōu)化型VP1重組蛋白的檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3抗體的膠體金免疫層析試紙條的研制等一系列研究,主要結(jié)果如下：1. DHAV-1 VP1基因稀有密碼子及抗原表位分析通過(guò)生物信息學(xué)在線網(wǎng)站分析1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)X株VP1基因稀有密碼子情況和抗原表位,發(fā)現(xiàn)VP1中含26個(gè)稀有密碼子,稀有密碼子含量較多,且存在五處連續(xù)稀有密碼子,1-72位氨基酸序列和83-238位氨基酸序抗原表位較豐富。并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性對(duì)VP1密碼子進(jìn)行改造,人工合成密碼子優(yōu)化型VP1 (optiVP1)基因。2.VP1和optiVP1基因克隆表達(dá)、鑒定及純化通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增了預(yù)期大小的DHAV-1-X VP1全基因序列,將目的片段VP1和optiVP1分別克隆至pET-28a(+)上,構(gòu)建兩種原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a (+)/VP1和pET-28a (+)/optiVP1并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果表明,只有optiVPl成功表達(dá),在0.4 mmol/LIPTG、37℃誘導(dǎo)12h的表達(dá)量最大,表達(dá)的重組蛋白大小約為32 kDa,以包涵體的形式存在。采用切膠回收方法獲得純度較高的重組蛋白,Western blot分析結(jié)果表明該蛋白可被兔抗DHAV-1抗體和兔抗DHAV-3抗體識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。3. optiVPl多克隆抗體的制備用純化的optiVP1蛋白免疫昆明鼠,制備的鼠抗optiVP1高免血清的間接ELISA效價(jià)達(dá)到1：51200,間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)該鼠抗optiVP1血清能識(shí)別DHAV-1和DHAV-3,表明optiVP1具有良好的免疫原性。4. 檢測(cè)DHAV抗體的金標(biāo)試紙條的研制及應(yīng)用以optiVP1蛋白為抗原制備了雙抗原夾心法(ICS-SM)和間接法(ICS-ID)檢測(cè)DHAV抗體的膠體金免疫層析試紙條,特異性試驗(yàn)結(jié)果表明制備的金標(biāo)試紙條能夠檢測(cè)DHAV-1抗體和DHAV-3抗體,對(duì)鴨疫里默氏菌(RA)、鴨瘟、鴨大腸桿菌和鴨沙門(mén)氏菌等鴨常見(jiàn)病的陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陰性,特異性好。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)DHAV-1陽(yáng)性血清作1：64稀釋時(shí),檢測(cè)結(jié)果仍呈陽(yáng)性；當(dāng)DHAV-3陽(yáng)性血清作1：32稀釋時(shí),檢測(cè)結(jié)果仍呈陽(yáng)性。對(duì)16份臨床鴨血清樣本的檢測(cè)限度結(jié)果表明雙抗原夾心法試紙條的靈敏度與中和試驗(yàn)相當(dāng)甚至高于中和試驗(yàn),間接法試紙條敏感性與中和試驗(yàn)相當(dāng)。雙抗原夾心法試紙條和間接法試紙條與間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為82.3%(93/113)和85.8%(97/113),與中和試驗(yàn)的符合率均為100%(16/16)。制備的雙抗原夾心法試紙條和間接法試紙條穩(wěn)定性好,可在4℃至少保存6個(gè)月。
【關(guān)鍵詞】：DHAV-1和DHAV-3 密碼子優(yōu)化的VP1蛋白 膠體金免疫層析試紙條
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 部分縮寫(xiě)詞及符號(hào)說(shuō)明表7-12
• 一、文獻(xiàn)綜述12-19
• 1 鴨甲肝病毒(DHAV)概述12-13
• 1.1 DHAV的病原學(xué)特性12
• 1.2 DHAV的分子生物學(xué)特征12-13
• 2 DHAV VP1基因及VP1蛋白的研究進(jìn)展13-14
• 3 鴨甲肝病毒病原和抗體的診斷方法14-16
• 3.1 根據(jù)臨床癥狀和病理剖檢病變?cè)\斷14-15
• 3.2 血清學(xué)診斷15-16
• 3.3 分子生物學(xué)診斷16
• 4 免疫膠體金技術(shù)16-18
• 4.1 基本原理17
• 4.2 應(yīng)用及發(fā)展前景17-18
• 5 選題目的及意義18-19
• 二、試驗(yàn)研究19-57
• 1 材料19-22
• 1.1 毒株、菌種、血清和試驗(yàn)動(dòng)物19
• 1.2 主要試劑19-20
• 1.3 其他試驗(yàn)材料20
• 1.4 常用試劑的配制20-22
• 2 主要儀器設(shè)備22
• 3 試驗(yàn)方法22-33
• 3.1 VP1基因和optiVP1的克隆、表達(dá)及純化22-27
• 3.1.1 VP1密碼子偏嗜性及抗原表位分析22
• 3.1.2 VP1密碼子優(yōu)化及基因合成22-23
• 3.1.3 引物設(shè)計(jì)23
• 3.1.4 病毒總RNA的提取23
• 3.1.5 VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增23-24
• 3.1.6 VP1基因的T克隆24
• 3.1.7 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建24-25
• 3.1.8 目的蛋白的表達(dá)及純化25-27
• 3.2 鼠抗optiVP1蛋白血清的制備及應(yīng)用27-28
• 3.2.1 鼠抗重組蛋白高免血清的制備27
• 3.2.2 基于鼠抗optiVP1血清的間接免疫熒光檢測(cè)DHAV-1和DHAV-327-28
• 3.3 膠體金免疫層析試紙條的研制28-31
• 3.3.1 抗原夾心法試紙條的研制28-30
• 3.3.2 間接法試紙條的研制30
• 3.3.3 試紙條性能評(píng)估30-31
• 3.4 間接ELISA檢測(cè)DHAV抗體31-32
• 3.4.1 DHAV-1的增殖及純化31
• 3.4.2 間接ELISA檢測(cè)DHAV抗體31-32
• 3.4.3 臨界值的確定32
• 3.4.4 特異性試驗(yàn)32
• 3.4.5 間接ELISA與金標(biāo)試紙條符合率的評(píng)估32
• 3.5 中和試驗(yàn)檢測(cè)DHAV抗體32-33
• 3.5.1 病毒TCID_(50)的測(cè)定32-33
• 3.5.2 中和效價(jià)的測(cè)定33
• 3.5.3 中和試驗(yàn)與金標(biāo)試紙條靈敏度和符合率的比較33
• 4 試驗(yàn)結(jié)果33-57
• 4.1 VP1密碼子偏嗜性分析及VP1密碼子優(yōu)化33-35
• 4.1.1 VP1密碼子偏嗜性及抗原表位分析33-34
• 4.1.2 VP1密碼子優(yōu)化34-35
• 4.2 VP1和optiVP1的克隆表達(dá)、鑒定及純化35-40
• 4.2.1 VP1的PCR擴(kuò)增35-36
• 4.2.2 VP1基因的T克隆36-37
• 4.2.3 VP1和optiVP1基因的亞克隆37
• 4.2.4 重組蛋白的表達(dá)37-39
• 4.2.5 重組蛋白o(hù)ptiVP1的純化39-40
• 4.3 鼠抗optiVP1蛋白血清的制備及運(yùn)用40-41
• 4.3.1 鼠抗optiVP1蛋白血清效價(jià)的測(cè)定40
• 4.3.2 基于鼠抗optiVP1抗體的間接免疫熒光檢測(cè)DHAV-1和DHAV-340-41
• 4.4 膠體金免疫層析試紙條的研制41-51
• 4.4.1 雙抗原夾心法試紙條的研制41-46
• 4.4.2 間接法試紙條的研制46-47
• 4.4.3 試紙條性能評(píng)價(jià)47-51
• 4.5 間接ELISA檢測(cè)DHAV抗體51-55
• 4.5.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的摸索51-52
• 4.5.2 酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度52-53
• 4.5.3 抗原的包被條件的優(yōu)化53
• 4.5.4 臨界值的確定53-54
• 4.5.5 特異性試驗(yàn)54
• 4.5.6 膠體金試紙條和間接ELISA符合率的評(píng)估54-55
• 4.6 中和試驗(yàn)檢測(cè)DHAV抗體55-57
• 4.6.1 病毒TCID_(50)的測(cè)定55-56
• 4.6.2 中和效價(jià)的測(cè)定56
• 4.6.3 中和試驗(yàn)與金標(biāo)試紙條靈敏度和符合率的比較56-57
• 三、討論57-62
• 1 optiVP1蛋白的原核表達(dá)、純化及活性分析57-58
• 2 雙抗原夾心法與間接法試紙條檢測(cè)DHAV抗體的優(yōu)缺點(diǎn)58-59
• 3 試紙條的保存及耗材的篩選59
• 4 基于optiVP1蛋白的膠體金試紙條的研制59-62
• 四、結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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8 時(shí)建立;戰(zhàn)翔;李俊;叢曉燕;孫文博;杜以軍;彭U，

本文編號(hào)：686694