本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒中和抗體ELISA檢測方法的優(yōu)化

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【摘要】：在中國,由狂犬病病毒引起人間狂犬病的死亡人數(shù)一直位居37種法定公開傳染病前列。其中,大多數(shù)案例與犬只咬傷相關(guān)。因此,確保犬只對狂犬病病毒的防御能力是切斷其向人間傳播的重要手段。目前,公認的量化犬只狂犬病病毒抵抗能力的方法是測定犬血液中中和抗體的水平。但中和試驗對實驗條件要求高且需要使用狂犬病病毒強毒株,而目前市面上的商品化試劑盒檢出的為狂犬病全病毒抗體。因而檢測狂犬病病毒的中和抗體難以普及。本研究的目的是完善一套準確而又便捷的狂犬病病毒中和抗體ELISA試劑盒。首先,確定表達狂犬病病毒糖蛋白優(yōu)勢抗原RV G3的工程菌能高效表達。用IPTG誘導4 h后,收集菌體。重懸并在低溫環(huán)境下超聲破碎菌體,收集包涵體沉淀。然后,通過8 mol/L尿素的溶解液溶解包涵體。過純化柱獲得高度純化的RV G3蛋白,以該蛋白為抗原包被反應(yīng)板,建立狂犬病病毒中和抗體間接ELISA方法。經(jīng)反復試驗,確定RV G3蛋白的最佳包被濃度是163μg/mL;最佳包被條件為37℃1.5h;最適的封閉劑是無蛋白封閉液;最佳封閉時間為1h;血清最佳稀釋度是1:10;最佳血清孵育時間是1.5h;最佳血清稀釋液為0.5%的脫脂乳;酶標二抗最適濃度為1:1000;最佳酶標二抗孵育時間為1h;底物液反應(yīng)時間為15min;讀數(shù)波長為450 nm。此外,重復性實驗表明批內(nèi)和批間重復性的變異系數(shù)均小于10%。敏感性實驗表明敏感度為1:160。利用此方法檢測22份犬血清樣品,計算的中和抗體滴度結(jié)果分別與商品化ELISA試劑盒和FAVN方法的結(jié)果比較,均說明檢測的結(jié)果有相同的趨勢,以及良好的相關(guān)性。本研究通過優(yōu)化原有的方法,建立了定量檢測狂犬病病毒中和抗體的間接ELISA方法,為加快普及狂犬病病毒中和抗體提供了新途徑。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 中和抗體 間接ELISA
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要2-3
• ABSTRACT3-4
• 英文縮寫對照表4-9
• 1 前言9-15
• 1.1 狂犬病病原學9-12
• 1.1.1 分類9-10
• 1.1.2 狂犬病病毒的基因結(jié)構(gòu)特征10-12
• 1.2 狂犬病病毒實驗室檢測方法12-13
• 1.2.1 小鼠分離病毒試驗(Mouse Isolation Test, MIT)12
• 1.2.2 細胞培養(yǎng)分離病毒技術(shù)(Cell-culture Isolation Technique, CIT)12
• 1.2.3 熒光抗體實驗(Fluorescent Antibody Test, FAT)12
• 1.2.4 快速狂犬病酶免疫診斷法(Rapid Rabies Enzyme Immunodetection, RREID)12-13
• 1.3 狂犬病病毒抗體的實驗室檢測方法13-14
• 1.3.1 小鼠病毒中和試驗(mouse neutralization test, MNT)13
• 1.3.2 熒光抗體病毒中和試驗(Fluorescent Antibody Virus Neutralization test, FAVN)13
• 1.3.3 快速熒光灶抑制試驗(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT)13
• 1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)13-14
• 1.4 本研究的目的與意義14-15
• 2 材料與方法15-24
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 毒株與血清15
• 2.1.2 主要試劑及配制15-17
• 2.1.2.1 工程菌的重新培養(yǎng)用試劑15
• 2.1.2.2 蛋白純化與鑒定用試劑15-16
• 2.1.2.3 間接ELISA用試劑16-17
• 2.1.2.4 FAVN用試劑17
• 2.1.3 主要儀器17
• 2.2 方法17-24
• 2.2.1 菌株的復蘇與PCR驗證17-18
• 2.2.2 目的蛋白的誘導表達與純化18-20
• 2.2.3 間接ELISA方法的建立20-24
• 2.2.3.1 ELISA反應(yīng)體系20-21
• 2.2.3.2 封閉液的確定21
• 2.2.3.3 血清稀釋液的確定21
• 2.2.3.4 最佳抗原濃度及最適血清濃度的選擇21
• 2.2.3.5 抗原包被條件的優(yōu)化21-22
• 2.2.3.6 血清孵育時間的優(yōu)化22
• 2.2.3.7 酶標抗體稀釋度的優(yōu)化22
• 2.2.3.8 酶標抗體孵育時間的優(yōu)化22
• 2.2.3.9 重復性實驗22
• 2.2.3.10 敏感性實驗22
• 2.2.3.11 與進口ELISA試劑盒的比較22-23
• 2.2.3.12 FAVN的比較23-24
• 3 結(jié)果與分析24-35
• 3.1 菌株的鑒定24-25
• 3.2 蛋白誘導與純化25-27
• 3.2.1 蛋白誘導表達的情況25
• 3.2.2 純化后目的蛋白條帶的鑒定25-26
• 3.2.3 蛋白濃度測定結(jié)果26-27
• 3.3 狂犬病病毒中和抗體間接ELISA方法的優(yōu)化27-35
• 3.3.1 封閉液的選擇27
• 3.3.2 血清稀釋液的優(yōu)化27-28
• 3.3.3 最佳抗原濃度和最適血清濃度的確定28
• 3.3.4 抗原包被時間的優(yōu)化28-29
• 3.3.5 封閉時間的優(yōu)化29
• 3.3.6 血清孵育時間的優(yōu)化29
• 3.3.7 酶標二抗稀釋度的確定29-30
• 3.3.8 酶標二抗孵育時間的優(yōu)化30
• 3.3.9 標準曲線方程的建立30-31
• 3.3.10 重復性實驗結(jié)果31-32
• 3.3.10.1 批內(nèi)重復性實驗結(jié)果及變異系數(shù)31-32
• 3.3.10.2 批間重復性實驗結(jié)果及變異系數(shù)32
• 3.3.11 敏感性實驗32-33
• 3.3.12 與進口ELISA試劑盒的結(jié)果比較33
• 3.3.13 與FAVN的結(jié)果比較33-35
• 4 討論35-38
• 4.1 包被蛋白的選取35
• 4.1.1 包被病毒與包被表達蛋白的比較35
• 4.1.2 不同毒株G基因的選擇35
• 4.1.3 表達RV G3蛋白的工程菌的優(yōu)勢35
• 4.2 濃縮純化RV G3蛋白的注意事項35-36
• 4.3 定量中和抗體的間接ELISA的注意事項36-38
• 4.3.1 酶標板36
• 4.3.2 封閉液和血清稀釋液36
• 4.3.3 包被36
• 4.3.4 洗滌36-37
• 4.3.5 顯色37
• 4.3.6 標準曲線37
• 4.3.7 特異性37
• 4.3.8 重復性37
• 4.3.9 敏感性37
• 4.3.10 與進口ELISA試劑盒的比較37
• 4.3.11 與FAVN的比較37-38
• 全文總結(jié)38-39
• 致謝39-40
• 參考文獻40-42

【參考文獻】

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本文編號：678763