本文關(guān)鍵詞：豬帶絳蟲(chóng)HSP70-4真核表達(dá)及其免疫佐劑效應(yīng)研究

  更多相關(guān)文章： 豬帶絳蟲(chóng) 豬囊尾蚴病 HSP70-4 真核表達(dá) 免疫佐劑

【摘要】：豬囊尾蚴病是豬帶絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)—囊尾蚴所引起的一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病,被世界衛(wèi)生組織列為17種最易被忽略的熱帶病之一。該病呈世界性分布,不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失,同時(shí)還威脅著人類的身體健康。雖然廣譜抗蠕蟲(chóng)藥吡喹酮、丙硫咪唑?qū)ωi囊尾蚴病有一定的治療效果,但其副作用嚴(yán)重,長(zhǎng)期使用還會(huì)產(chǎn)生耐藥性。因此,疫苗的研究顯得尤為重要。豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18重組蛋白作為主要的候選抗原之一,具有較好的免疫保護(hù)力,但穩(wěn)定性較差,分子量小(僅為16ku),對(duì)其免疫效果造成了一定影響。熱休克蛋白70(Heat shock Protein70,HSP70)是一類在結(jié)構(gòu)和功能上高度保守的蛋白,具有分子伴侶、抗原遞呈、抗感染免疫、抑制細(xì)胞凋亡等作用,現(xiàn)已被廣泛用作佐劑或抗原載體來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)力。為了提高豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18重組蛋白的穩(wěn)定性以及免疫保護(hù)力,我們開(kāi)展了將豬帶絳蟲(chóng)HSP70-4(TsHSP70-4)作為免疫佐劑的研究,目的是為豬帶絳蟲(chóng)基因工程疫苗免疫佐劑的選擇提供新的思路。研究取得了如下結(jié)果:1.參考GeneDB中豬帶絳蟲(chóng)基因組注釋信息,設(shè)計(jì)特異性引物,RT-PCR獲得TsHSP70-4 ORF序列,全長(zhǎng)為1953bp。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性,對(duì)TsHSP70-4基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化,連接載體pPIC9K,在畢赤酵母中進(jìn)行高效表達(dá),獲得大小約為95kD的重組蛋白。Western-blot檢測(cè)及質(zhì)譜分析表明,獲得的重組蛋白即為TsHSP70-4。2.將TsHSP70-4用柔性linker與豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18的N端相連,在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá),獲得了大小約為115kD的融合蛋白TsHSP70-4-TSOL18。3.以TsHSP70-4作為佐劑,與TSOL18混合免疫(即TsHSP70-4+TSOL18免疫組)可以延長(zhǎng)其在小鼠體內(nèi)的作用時(shí)間;在免疫的第18天,該免疫組小鼠血清中IL-4、IFN-γ的濃度與TSOL18免疫組相比較,存在顯著提高(P0.05);在第21天,該免疫組小鼠血清中IL-10的濃度與TSOL18免疫組比較,有明顯增強(qiáng)(P0.01);在第21天和第28天,對(duì)全血T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定分析,該免疫組CD3+CD4+的百分率均有顯著提高(P0.05)。由此可知,TsHSP70-4與TSOL18混合免疫,可以延長(zhǎng)TSOL18在體內(nèi)的滯留時(shí)間,增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力,特別是體液免疫水平。4.用TsHSP70-4-TSOL18融合蛋白免疫小鼠,獲得的免疫效果遠(yuǎn)低于TsHSP70-4+TSOL18免疫組和TSOL18免疫組。綜合上述,TsHSP70-4可以作為TSOL18重組蛋白潛在的免疫佐劑。TsHSP70-4-TSOL18融合蛋白免疫效果較差,推測(cè)可能與融合的方向和方式有關(guān),具體原因有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：豬帶絳蟲(chóng) 豬囊尾蚴病 HSP70-4 真核表達(dá) 免疫佐劑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.734
【目錄】：

• 摘要5-6
• abstract6-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 豬帶絳蟲(chóng)概述12-14
• 1.1.1 豬帶絳蟲(chóng)及豬囊尾蚴病12
• 1.1.2 豬囊尾蚴病免疫學(xué)診斷的研究進(jìn)展12-13
• 1.1.3 豬囊尾蚴病的治療與預(yù)防13-14
• 1.2 熱休克蛋白70概述14-19
• 1.2.1 熱休克蛋白發(fā)現(xiàn)及分類14
• 1.2.2 HSP70家族的結(jié)構(gòu)特征及分類14-15
• 1.2.3 HSP70的生物學(xué)功能15-17
• 1.2.4 HSP70在寄生蟲(chóng)中的研究進(jìn)展17-19
• 1.3 研究目的與意義19-20
• 第二章 TsHSP70-4 基因克隆及序列分析20-27
• 2.1 材料與方法20-21
• 2.1.1 蟲(chóng)株、菌株及試劑20
• 2.1.2 主要儀器20
• 2.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成20
• 2.1.4 豬帶絳蟲(chóng)總RNA的提取20-21
• 2.1.5 c DNA的合成21
• 2.1.6 TsHSP70-4 基因的擴(kuò)增21
• 2.1.7 TsHSP70-4 生物信息學(xué)分析21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 2.2.1 總RNA的提取21-22
• 2.2.2 TsHSP70-4 基因的擴(kuò)增與測(cè)序22-23
• 2.2.3 TsHSP70-4 生物信息學(xué)分析23-26
• 2.3 討論26-27
• 第三章 TsHSP70-4 真核表達(dá)27-33
• 3.1 材料與方法27-29
• 3.1.1 載體、菌株與試劑27
• 3.1.2 主要儀器27
• 3.1.3 重組質(zhì)粒p PIC9K-TsHSP70-4 的構(gòu)建27-28
• 3.1.4 重組質(zhì)粒p PIC9K-TsHSP70-4 線性化28
• 3.1.5 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備28
• 3.1.6 電擊轉(zhuǎn)化與菌落篩選28-29
• 3.1.7 TsHSP70-4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)29
• 3.1.8 TsHSP70-4 重組蛋白的純化與鑒定29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-32
• 3.2.1 重組質(zhì)粒p PIC9K-TsHSP70-4 線性化29-30
• 3.2.2 TsHSP70-4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30-31
• 3.2.3 TsHSP70-4 重組蛋白的純化31
• 3.2.4 純化后的TsHSP70-4 的Western-blot及質(zhì)譜鑒定31-32
• 3.3 討論32-33
• 第四章 TsHSP704TSOL18真核表達(dá)33-39
• 4.1 材料與方法33-34
• 4.1.1 載體、菌株與試劑33
• 4.1.2 主要儀器33
• 4.1.3 重組質(zhì)粒p PIC9K-TsHSP704TSOL18的構(gòu)建33
• 4.1.4 重組質(zhì)粒p PIC9K-TsHSP704TSOL18線性化33-34
• 4.1.5 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備34
• 4.1.6 電擊轉(zhuǎn)化與菌落篩選34
• 4.1.7 TsHSP704TSOL18重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)34
• 4.1.8 TsHSP704TSOL18重組蛋白的純化與鑒定34
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-37
• 4.2.1 重組質(zhì)粒p PIC9K-TsHSP704TSOL18線性化34-35
• 4.2.2 TsHSP704TSOL18重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)35-36
• 4.2.3 TsHSP704TSOL18重組蛋白的純化36
• 4.2.4 TsHSP704TSOL18重組蛋白的Western-blot鑒定36-37
• 4.3 討論37-39
• 第五章 TsHSP70-4 的免疫佐劑效應(yīng)39-47
• 5.1 材料與方法39-41
• 5.1.1 主要試劑39
• 5.1.2 主要儀器39
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物39
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)小鼠分組39-40
• 5.1.5 實(shí)驗(yàn)小鼠免疫與采血40
• 5.1.6 實(shí)驗(yàn)小鼠血清TSOL18抗體的檢測(cè)40-41
• 5.1.7 實(shí)驗(yàn)小鼠IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 的檢測(cè)41
• 5.1.8 實(shí)驗(yàn)小鼠全血T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定41
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠血清TSOL18抗體的檢測(cè)41-42
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 的檢測(cè)42-44
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠全血T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定44-45
• 5.3 討論45-47
• 第六章 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 致謝53-54
• 作者簡(jiǎn)歷54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：676401