本文關(guān)鍵詞：田鼠巴貝斯蟲兩個(gè)硫氧還蛋白基因的克隆及鑒定

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【摘要】：巴貝斯蟲病是由巴貝斯蟲寄生在宿主紅細(xì)胞中引起的一種血液寄生蟲病,主要通過(guò)硬蜱傳播。田鼠巴貝斯蟲(Babesia microti)感染動(dòng)物和人,主要癥狀為發(fā)熱、頭痛、疲勞、貧血等,對(duì)免疫缺陷和免疫力低下的人群具有致死性,嚴(yán)重危害人類健康,是一種新發(fā)蜱傳疾病。硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)是一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白質(zhì),它和硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,Trx R)、NADPH共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng),是硫氧還蛋白系統(tǒng)的重要組成部分。對(duì)瘧原蟲等血液原蟲的研究發(fā)現(xiàn),它們生存依賴氧化還原系統(tǒng)清除體內(nèi)的氧化物,硫氧還蛋白系統(tǒng)發(fā)揮著氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御的核心功能。目前,巴貝斯蟲硫氧還蛋白系統(tǒng)還缺少研究。本研究旨在鑒定田鼠巴貝斯蟲Trx分子,為了解巴貝斯蟲的硫氧還蛋白系統(tǒng)分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。本研究結(jié)果包括以下4個(gè)方面:一、通過(guò)田鼠巴貝斯蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,利用生物信息學(xué)軟件比對(duì)分析,篩選出田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白(Trx)基因序列。通過(guò)3’和5’RACE技術(shù)克隆全長(zhǎng)田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3基因。氨基酸序列分析顯示,田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3基因都具有典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域和WCGPC活性位點(diǎn)。二、構(gòu)建了以p ET-30a為載體的重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,在1m M IPTG誘導(dǎo)下,成功進(jìn)行了重組蛋白的表達(dá),經(jīng)親和層析純化,獲得重組蛋白。三、胰島素還原實(shí)驗(yàn)顯示,重組Trx-2和Trx-3蛋白都有還原活性。Trx-2還原活性隨反應(yīng)時(shí)間增加不斷增大,4分鐘后達(dá)到平穩(wěn)峰值;Trx-3還原活性迅速,即刻達(dá)到平穩(wěn)峰值,與陽(yáng)性對(duì)照組相似。四、通過(guò)Western blot鑒定,證明蟲體Trx-2和Trx-3天然蛋白的分子量大小分別為15.5k Da和21.7k Da,且蟲體在紅細(xì)胞中分裂高峰期時(shí)Trx-2和Trx-3大量表達(dá)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFAT)證明Trx-2和Trx-3天然蛋白主要存在于細(xì)胞漿中。綜上所述,本研究克隆了田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3全長(zhǎng)基因,完成兩個(gè)重組蛋白的表達(dá)和活性分析,確定了兩個(gè)分子的大小和初步定位。為闡明巴貝斯蟲的硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)分子機(jī)制和篩選新型藥物靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：田鼠巴貝斯蟲 硫氧還蛋白 原核表達(dá) 蛋白活性分析
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;S852.7
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-9
• 第一章 綜述9-16
• 1.1 原蟲Trx結(jié)構(gòu)9-10
• 1.2 Trx的生物活性與功能10-14
• 1.3 Trx抑制劑14-15
• 1.4 小結(jié)15-16
• 第二章 田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白基因的克隆16-39
• 2.1 引言16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.2.1 材料16
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法17-27
• 2.3.1 收集昆明小白鼠紅細(xì)胞中的田鼠巴貝斯蟲蟲體17
• 2.3.2 田鼠巴貝斯蟲總RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序17-18
• 2.3.3 田鼠巴貝斯蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA18
• 2.3.4 硫氧還蛋白保守片段的擴(kuò)增18-21
• 2.3.5 Trx-2、Trx-3 的 3’端快速擴(kuò)增21-23
• 2.3.6 Trx-2、Trx-3 的 5’端快速擴(kuò)增23-26
• 2.3.7 全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增26-27
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-37
• 2.4.1 總RNA的提取27-28
• 2.4.2 保守片段的擴(kuò)增28-29
• 2.4.3 3’端快速擴(kuò)增29-31
• 2.4.4 5’端快速擴(kuò)增31-33
• 2.4.5 全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增33-37
• 2.5 討論37-39
• 第三章 硫氧還蛋白基因的原核表達(dá)39-53
• 3.1 引言39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料39-40
• 3.2.1 材料39
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器39-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法40-47
• 3.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建40-43
• 3.3.2 重組蛋白表達(dá)形式分析43-45
• 3.3.3 蛋白純化及定量45-47
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-51
• 3.4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建47-48
• 3.4.2 重組蛋白表達(dá)形式分析48-49
• 3.4.3 蛋白純化及定量49-51
• 3.5 討論51-53
• 第四章 硫氧還蛋白重組蛋白活性分析53-57
• 4.1 引言53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-55
• 4.5 討論55-57
• 第五章 Trx-2 和Trx-3 在蟲體中天然蛋白的Western鑒定及IFAT實(shí)驗(yàn)57-66
• 5.1 引言57
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料57-58
• 5.2.1 材料57
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器57-58
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法58-60
• 5.3.1 多抗血清的制備58
• 5.3.2 Western blot鑒定58-59
• 5.3.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFAT）檢測(cè)59-60
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-64
• 5.4.1 Trx-2 和Trx-3 多抗血清的Western blot鑒定60-62
• 5.4.2 His單抗的Western blot鑒定62
• 5.4.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFAT）檢測(cè)62-64
• 5.5 討論64-66
• 第六章 全文總結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 附錄73-81
• 作者簡(jiǎn)介81-82
• 致謝82-83

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本文編號(hào)：647441