發(fā)布時(shí)間：2017-08-09 20:20

  本文關(guān)鍵詞：牛源A型多殺性巴氏桿菌三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能研究

  更多相關(guān)文章： 多殺性巴氏桿菌 TAAs 免疫保護(hù) 細(xì)胞粘附 生物膜形成

【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)屬于革蘭氏陰性菌,根據(jù)其莢膜抗原不同分為A、B、E、D、F 5種血清型,根據(jù)其菌體抗原不同分為16個(gè)血清型。P.Multocida能夠感染多種動(dòng)物,引起牛出血性敗血癥、牛肺炎、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎等,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌感染機(jī)體過(guò)程中,細(xì)菌的定殖和繁殖與其粘附素有著密切關(guān)系。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一種新的非菌毛粘附素-三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素(TAAs),被認(rèn)為是一種重要的毒力因子,它主要由頭部、莖部和錨定部三部分組成,其中頭部和莖部是其主要功能區(qū),參與細(xì)菌的粘附、侵襲、生物膜形成,與其自身凝集和抗血清作用也有一定關(guān)系;錨定部是TAAs家族特有的結(jié)構(gòu),具有三聚化作用,可以抑制SDS變性作用。來(lái)源于不同細(xì)菌TAAs的錨定部序列具有高度同源性,不同的氨基酸個(gè)數(shù)決定了TAAs的多樣性。此外TAAs也可以作為研究新型亞單位疫苗的候選靶標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)TAAs的研究比較少,只對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的TAAs有相關(guān)研究,但是關(guān)于巴氏桿菌還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)生物信息學(xué)分析得到一個(gè)牛源A型多殺性巴氏桿菌的假定三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因pm1g0001。本實(shí)驗(yàn)將其作為研究對(duì)象,通過(guò)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)從理論和試驗(yàn)方面證明其編碼的pm1g0001蛋白是YadA屬三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;并通過(guò)免疫反應(yīng)原性分析、粘附活性分析、生物膜形成方面來(lái)研究該蛋白具有的部分TAAs生物學(xué)功能。具體研究結(jié)果如下:1、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素編碼基因pm1g0001的生物信息學(xué)分析根據(jù)本試驗(yàn)室建立的牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株基因數(shù)據(jù)庫(kù),利用生物信息學(xué)在線分析軟件SignalP-3.0 server、TMHMM Server v.2.0、SMART對(duì)假定三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素Pm1g0001基因的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;利用三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分析軟件daTAA分析蛋白的黏附基序。結(jié)果顯示,該蛋白編碼基因Pm1g0001的1-22aa為信號(hào)肽區(qū)域、1-84aa為跨膜域、211-411aa為T(mén)AAs部分,其中taas的ylhead頭部基序主要位于n端211-284aa處,莖部主要位于295-341aa,c端錨定部基序主要位于323-411aa處,說(shuō)明該蛋白含有三聚體典型的頭-莖-錨結(jié)構(gòu),從理論上證明該假定蛋白是三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。利用bcepredserver在線軟件對(duì)蛋白pm1g0001的b抗原表位進(jìn)行線性化的預(yù)測(cè);利用bepipred1.0server在線軟件和dnastar軟件包分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、親水性、可極性等,預(yù)測(cè)蛋白pm1g0001的b抗原表位,綜合分析表明,pm1g0001的抗原表位主要位于21-315aa。2、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的分段表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物western-blot分析生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),三聚體部分主要位于pm1g0001基因編碼蛋白的211-411aa。根據(jù)分析結(jié)果,將pm1g0001分為整個(gè)pm1g0001基因(pm1g0001)、整個(gè)功能區(qū)(頭部和頸部:pm1g0001-1)、錨定部(pm1g0001-2)、整個(gè)三聚體部分(pm1g0001-3)、非三聚體部分(pm1g0001-4)、頭部(pm1g0001-5)和莖部(pm1g0001-6)7段,分別設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行pcr擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,以pet-30a(+)或pet-32a(+)為載體,轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)中構(gòu)建重組質(zhì)粒,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到重組蛋白。利用his親和層析柱將7個(gè)重組蛋白進(jìn)行大量純化,并將產(chǎn)物進(jìn)行western-blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)重組蛋白都具有良好的反應(yīng)原性;此外,重組蛋白rpm1g0001-2在78kda處有條帶,是單體重組蛋白(26kda)的3倍,說(shuō)明該蛋白錨定部具有三聚化的作用,由此證明蛋白pm1g0001是三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。3、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pm1g0001的功能研究將純化后的重組蛋白rpm1g0001、rpm1g0001-1~rpm1g0001-6分別與佐劑混合后免疫小鼠,三免后,采集小鼠血液分離血清,采用elisa檢測(cè)其抗體效價(jià);同時(shí)用6.8×105cfu的pmcq2肌肉注射攻毒小鼠,研究目的蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示,免疫組抗體效價(jià)范圍在1:51200~1:102400,說(shuō)明重組蛋白可以刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng);其中重組蛋白rpm1g0001-3的抗體效價(jià)明顯高于其余6組,說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示,重組蛋白rpm1g0001-3的保護(hù)效果最好,保護(hù)率達(dá)到70%,說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素對(duì)巴氏桿菌的感染具有很好的保護(hù)作用;重組蛋白rpm1g0001-5和rpm1g0001的保護(hù)率達(dá)到60%,rpm1g0001-1和rpm1g0001-6的保護(hù)率是40%,rpm1g0001-2保護(hù)率僅為10%,說(shuō)明在整個(gè)rpm1g0001中起主要作用的是三聚體部分,而在三聚體中起主要作用的是功能區(qū),其中功能區(qū)頭部作用效果好于莖部。將純化后的重組蛋白rPm1g0001-1、rPm1g0001-3、rPm1g0001-5、rPm1g0001-6免疫小鼠,制備多克隆抗體。用制備好的抗體和陰性血清對(duì)C57BL/6小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后,加入PmCQ2感染4h,洗去未粘附的細(xì)菌,經(jīng)洗脫后進(jìn)行粘附計(jì)數(shù),以研究重組蛋白抗體對(duì)巴氏桿菌粘附小鼠巨噬細(xì)胞的影響。結(jié)果表明,四種多克隆抗體都對(duì)PmCQ2粘附巨噬細(xì)胞有一定的抑制作用,且差異顯著;其中抗-Pm1g0001-3對(duì)細(xì)菌粘附的抑制效果明顯好于其余三組,說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體對(duì)巴氏桿菌粘附宿主細(xì)胞具有一定的抑制作用,其中起主要作用的是功能區(qū)。將PmCQ2(1×108 CFU)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中分別培養(yǎng)24h、48h、72h,檢測(cè)生物膜形成情況,在此基礎(chǔ)上,將制備的多克隆抗體抗-Pm1g0001-1、抗-Pm1g0001-3、抗-Pm1g0001-5、抗-Pm1g0001-6與陰性血清分別對(duì)含細(xì)菌的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行預(yù)處理,并測(cè)定各組的吸光值A(chǔ)630,以研究重組蛋白抗體對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響。結(jié)果表明,多殺性巴氏桿菌PmCQ2可以形成細(xì)菌生物膜,48h時(shí)形成生物膜現(xiàn)象最明顯;經(jīng)抗體預(yù)處理的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組A630極顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明4種抗體都能夠抑制細(xì)菌生物膜的形成,且在48h時(shí)抑制效果最好;48h時(shí),抗-Pm1g0001-1的抑制效果最佳,抗-Pm1g0001-3的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5和抗-Pm1g0001-6,抗-Pm1g0001-6的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5,說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體可以抑制細(xì)菌生物膜的形成,其中功能區(qū)起主要作用,且功能區(qū)中莖部抑制效果好于頭部。
【關(guān)鍵詞】：多殺性巴氏桿菌 TAAs 免疫保護(hù) 細(xì)胞粘附 生物膜形成
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-31
• 1.1 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素的研究進(jìn)展13-19
• 1.1.1 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素的結(jié)構(gòu)13-15
• 1.1.2 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素的分泌機(jī)制15-16
• 1.1.3 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素的分類(lèi)及功能16-19
• 1.2 多殺性巴氏桿菌的研究進(jìn)展19-31
• 1.2.1 多殺性巴氏桿菌的概況19-21
• 1.2.2 多殺性巴氏桿菌的主要毒力因子21-25
• 1.2.3 多殺性巴氏桿菌的疫苗研究25-31
• 第2章 引言31-33
• 2.1 研究目的及意義31
• 2.2 研究的主要內(nèi)容31-32
• 2.2.1 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Pm1g0001的生物信息學(xué)分析31
• 2.2.2 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素編碼基因的分段表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析31-32
• 2.2.3 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pm1g0001的功能研究32
• 2.3 技術(shù)路線32-33
• 第3章 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Pm1g0001生物信息學(xué)分析33-43
• 3.1 生物信息分析軟件33-34
• 3.1.1 結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)33
• 3.1.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè)33
• 3.1.3 理化性質(zhì)分析33-34
• 3.1.4 抗原表位預(yù)測(cè)34
• 3.1.5 粘附功能區(qū)預(yù)測(cè)34
• 3.2 結(jié)果34-41
• 3.2.1 結(jié)構(gòu)域和跨膜域預(yù)測(cè)結(jié)果34-35
• 3.2.2 信號(hào)肽分析結(jié)果35
• 3.2.3 理化性質(zhì)分析35-36
• 3.2.4 抗原表位分析36-41
• 3.2.5 粘附基序分析41
• 3.3 討論41-43
• 第4章 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素編碼基因的分段表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析43-59
• 4.1 材料43-46
• 4.1.1 菌株及質(zhì)粒43
• 4.1.2 主要試劑盒43
• 4.1.3 酶及主要生物試劑43-44
• 4.1.4 主要試劑的配制44-46
• 4.2 方法46-52
• 4.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成46-47
• 4.2.2 模板DNA的提取47
• 4.2.3 目的基因的擴(kuò)增47-48
• 4.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化48
• 4.2.5 重組載體的構(gòu)建48-50
• 4.2.6 目的基因的原核表達(dá)50-51
• 4.2.7 重組蛋白的純化51
• 4.2.8 重組蛋白Western-blot分析51-52
• 4.3 結(jié)果52-56
• 4.3.1 目的基因的擴(kuò)增52
• 4.3.2 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證52-53
• 4.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)53-54
• 4.3.4 表達(dá)蛋白的純化54-55
• 4.3.5 重組蛋白Western-blot分析55-56
• 4.4 討論56-59
• 第5章 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pm1g0001的功能研究59-71
• 5.1 材料59-61
• 5.1.1 菌種59
• 5.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物59
• 5.1.3 試劑59
• 5.1.4 主要化學(xué)試劑的配制59-60
• 5.1.5 主要儀器60-61
• 5.2 方法61-63
• 5.2.1 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)61-62
• 5.2.2 細(xì)胞粘附試驗(yàn)62
• 5.2.3 生物膜試驗(yàn)[193]62-63
• 5.3 結(jié)果63-68
• 5.3.1 抗體效價(jià)檢測(cè)63-64
• 5.3.2 小鼠免疫保護(hù)性試驗(yàn)64-66
• 5.3.3 細(xì)胞粘附試驗(yàn)66
• 5.3.4 生物膜形成試驗(yàn)66-68
• 5.4 討論68-71
• 5.4.1 抗原表位與其免疫反應(yīng)原性分析68-69
• 5.4.2 Pm1g0001蛋白功能區(qū)分析69-71
• 第6章 結(jié)論71-73
• 6.1 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Pm1g0001生物信息學(xué)分析71
• 6.2 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的分段表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析71
• 6.3 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pm1g0001蛋白功能研究71-73
• 參考文獻(xiàn)73-85
• 附表85-87
• 致謝87

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本文編號(hào)：647129