本文關(guān)鍵詞：3型鴨甲肝病毒在SPF雞胚上的傳代及VP1基因變異規(guī)律的研究

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【摘要】：鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是3周齡內(nèi)雛鴨的一種急性、高度接觸性和致死性的傳染病�；疾‰r鴨的主要癥狀是肝炎,其病原是鴨肝炎病毒。該病以病程短、死亡率高、傳播速度快為特點(diǎn),通常發(fā)病日齡越小,病死率越高。成年鴨一般可以感染但是不發(fā)病,所以又稱為小鴨肝炎。鴨病毒性肝炎可由小RNA病毒科禽肝病毒屬鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)和星狀病毒科禽星狀病毒屬的鴨星狀病毒(duck astrovirus,DAst V)引起。DHAV分為1型、2型和3型3個(gè)血清型。當(dāng)前在我國流行的鴨肝炎病毒主要是DHAV-1,2002年以來DHAV-3在我國被發(fā)現(xiàn)并在我國部分地處流行,近年來DHAV-1和DHAV-3在鴨群中混合感染的現(xiàn)象比較普遍。而在我國,疫苗接種是預(yù)防鴨肝炎最基本最有效的措施,但生產(chǎn)中使用傳統(tǒng)的疫苗往往不能達(dá)到令人滿意的效果。DHAV-3給養(yǎng)鴨業(yè)造成的危害越來越廣泛,鴨肝炎的防控情形不容樂觀。因此,加快鴨肝炎多價(jià)疫苗的深入研究顯得尤為重要。DHAV-3基因組中的VP1蛋白作為主要的衣殼蛋白,能夠編碼病毒主要的保護(hù)性抗原位點(diǎn),并能識(shí)別相應(yīng)的受體,并且在不同毒株中的變異較大,具有最大遺傳多樣性,其變異的生物學(xué)意義值得深入研究。為了馴化DHAV-3野毒株獲得弱毒疫苗株,本研究選擇五株病毒在SPF雞胚上進(jìn)行傳代試驗(yàn),通過對(duì)VP1基因的克隆測(cè)序以及序列的比對(duì)分析,為DHAV-3的遺傳變異提供相關(guān)的理論依據(jù)。本研究主要分為兩個(gè)部分:第一部分:5株DHAV-3病毒在SPF雞胚上的傳代致弱取5株DHAV-3強(qiáng)毒(1C、2C、3C、4C 4株野毒和分子克隆化病毒5C)經(jīng)過處理后作為初代毒,經(jīng)尿囊腔接種9-12日齡SPF雞胚,接種量為0.2 mL/胚。留存24小時(shí)后的死亡雞胚,在4℃冰箱冷卻4-12 h后,無菌收取雞胚尿囊液并觀察胚胎病變,將所收尿囊液對(duì)應(yīng)接入下一批雞胚,連續(xù)傳代80代。結(jié)果表明:5株DHAV-3病毒雞胚傳代5代之前,24-96h之間雞胚并無死亡現(xiàn)象,胚體也無明顯病變;連續(xù)傳到第6代時(shí),雞胚開始出現(xiàn)死亡,傳到第19代時(shí),5株病毒接種雞胚出現(xiàn)全部死亡,但死亡時(shí)間不規(guī)律;傳到第36代后雞胚死亡時(shí)間基本在120h內(nèi);傳到第55代時(shí)雞胚死亡時(shí)間大多集中在48h~72h之間;在73代以后接種的雞胚的死亡時(shí)間基本穩(wěn)定在36h~48h之間,直到傳到80代時(shí)胚體的病變明顯、死亡時(shí)間趨于恒定,穩(wěn)定在48h。除此之外,在傳代的過程中,通過對(duì)各毒株各代次死亡的雞胚進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),尿囊液呈半透明狀,隨著傳代次數(shù)的增加雞胚的死亡時(shí)間縮短,胚體的病理變化越來越明顯,胚體發(fā)育漸漸變緩慢,胚體嚴(yán)重充血,胚體頭部和身體表面及四肢出現(xiàn)大量點(diǎn)狀出血,肝臟呈黃綠色或土黃色,有點(diǎn)狀或者斑點(diǎn)狀出血,胚體的大小比正常雞胚要小。取4C和5C兩株病毒傳代后的第2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80代病毒的尿囊液肌肉接種雛鴨進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示4C和5C毒株的前10代病毒可引起雛鴨的發(fā)病和死亡,并且器官組織有明顯的病理變化。第15代到第80代的雞胚傳代毒都不引起雛鴨發(fā)病和死亡,但第15代到第20代病毒可導(dǎo)致雛鴨肝臟出現(xiàn)輕微病變,從第30代開始雛鴨的肝臟不再發(fā)生組織性病變,表明經(jīng)過SPF雞胚傳代后,DHAV-3病毒的毒力逐漸致弱,并且30代以后不再對(duì)雛鴨致病,一直到第80代病毒毒力穩(wěn)定。第二部分:DHAV-3各毒株各代次雞胚傳代毒VP1基因的測(cè)序及序列分析將各個(gè)毒株傳代得到的病毒每隔5-10代進(jìn)行VP1基因的克隆測(cè)序,將得到的基因序列和氨基酸序列分別進(jìn)行橫向和縱向的比較。比對(duì)后發(fā)現(xiàn):5株DHAV-3分離株在SPF雞胚上的變異規(guī)律并不相同。在SPF雞胚上傳代的過程中,5株DHAV-3病毒毒力減弱。不同毒株不同代次的VP1蛋白的氨基酸變異位點(diǎn)都發(fā)生了反復(fù)變異和同步變異的現(xiàn)象,不同毒株的VP1蛋白有不同數(shù)目的氨基酸位于高變區(qū),但并不能總結(jié)出相同的規(guī)律,說明DHAV-3的毒力變化與VP1蛋白的突變沒有直接的關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：DHAV-3 SPF雞胚 傳代 致弱 VP1 變異
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 符號(hào)說明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 引言13-32
• 1.1 病毒的病原學(xué)14-16
• 1.1.1 DHAV病原學(xué)分類14
• 1.1.2 DHAV的形態(tài)學(xué)14
• 1.1.3 DHAV病毒的抵抗力14-15
• 1.1.4 DHAV的生物學(xué)特性15
• 1.1.5 病毒的致病力和致病機(jī)理15-16
• 1.2 鴨肝炎病毒的流行病學(xué)16-17
• 1.2.1 病毒的宿主17
• 1.2.2 病毒的傳播途徑17
• 1.3 鴨肝炎病毒的臨床癥狀和病理變化17-18
• 1.4 DHAV的分子生物學(xué)研究18-20
• 1.4.1 病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)18-19
• 1.4.2 DHAV的變異性19-20
• 1.5 VP1蛋白20-21
• 1.6 鴨甲肝病毒的增殖培養(yǎng)和純化21-23
• 1.6.1 胚胎培養(yǎng)21
• 1.6.2 細(xì)胞增殖培養(yǎng)21-23
• 1.6.3 DHAV的純化23
• 1.7 鴨甲肝病毒的診斷方法23-29
• 1.7.1 病毒的分離23-24
• 1.7.2 病毒的鑒定24
• 1.7.3 臨床診斷24-25
• 1.7.4 分子生物學(xué)診斷25
• 1.7.5 血清學(xué)檢測(cè)手段25-29
• 1.7.5.1 血清中和試驗(yàn)（Virus-neutralization test, VN）25-26
• 1.7.5.2 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)26
• 1.7.5.3 間接血凝試驗(yàn)26-27
• 1.7.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）27-28
• 1.7.5.5 免疫組化技術(shù)28-29
• 1.7.5.5 其他血清學(xué)診斷方法29
• 1.8 DHAV的預(yù)防和治療29-30
• 1.9 本研究的目的和意義30-32
• 2 材料與方法32-41
• 2.1 材料32-34
• 2.1.1 病料和菌株32
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32
• 2.1.3 主要儀器32
• 2.1.4 主要試劑32
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用溶液配制32-33
• 2.1.6 引物設(shè)計(jì)和合成33-34
• 2.2 方法34-41
• 2.2.1 DHAV-35 株毒在SPF雞胚上的傳代試驗(yàn)34
• 2.2.2 各毒株各代次雞胚傳代毒VP1基因的測(cè)序34-41
• 2.2.2.1 病毒RNA的提取34-35
• 2.2.2.2 病毒的RT-PCR鑒定35
• 2.2.2.3 PCR擴(kuò)增35-36
• 2.2.2.4 PCR產(chǎn)物的回收36-37
• 2.2.2.5 連接37
• 2.2.2.6 DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備37-38
• 2.2.2.7 轉(zhuǎn)化38
• 2.2.2.8 質(zhì)粒DNA的提取38-39
• 2.2.2.9 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定39
• 2.2.2.10 陽性克隆序列測(cè)定39
• 2.2.2.11 VP1序列分析39-40
• 2.2.2.12 動(dòng)物回歸試驗(yàn)40-41
• 3 結(jié)果與分析41-57
• 3.1 傳代后胚體死亡規(guī)律41-42
• 3.2 DHAV-3 雞胚傳代毒的VP1序列測(cè)定42
• 3.3 陽性質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果42-43
• 3.4 5株DHAV-3 病毒傳代后各代次VP1蛋白克隆測(cè)序后基因及氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果及分析43-57
• 3.4.1 1C傳代后各代次VP1蛋白克隆測(cè)序后基因及氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果及分析43-45
• 3.4.2 2C傳代后各代次VP1蛋白克隆測(cè)序后基因及氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果及分析45-47
• 3.4.3 3C傳代后各代次VP1蛋白克隆測(cè)序后基因及氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果及分析47-49
• 3.4.4 4C傳代后各代次VP1蛋白克隆測(cè)序后基因及氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果及分析49-51
• 3.4.5 5C傳代后各代次VP1蛋白克隆測(cè)序后基因及氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果及分析51-53
• 3.4.6 5株病毒之間變異情況的比較53-55
• 3.4.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果55-57
• 4 討論57-60
• 5 結(jié)論60-61
• 6 參考文獻(xiàn)61-69
• 7 致謝69

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本文編號(hào)：642834