發(fā)布時間：2017-08-03 19:26

  本文關鍵詞：一株可裂解大腸桿菌和沙門氏菌的噬菌體基因組學分析及其裂解酶活性鑒定

  更多相關文章： 大腸桿菌 沙門氏菌 噬菌體 基因組學 裂解酶

【摘要】：大腸桿菌和沙門氏菌是兩種重要的人畜共患病的病原,在世界范圍內(nèi)已經(jīng)造成了重大的經(jīng)濟損失并嚴重威脅著公共衛(wèi)生安全。隨著抗生素的大量和不合理使用,這兩種細菌的多重耐藥菌株層出不窮,使得新型有效抗菌制劑的開發(fā)迫在眉睫。由于噬菌體及其裂解酶與細菌長期共同進化,且具有高效殺菌活性,因此這兩者作為新的抗生素替代物或者是對抗生素的一種補充得到科學界的重視。本研究旨在分離鑒定針對大腸桿菌和沙門氏菌的多價噬菌體,并獲取其裂解酶,試圖開發(fā)針對這兩種致病菌的新型抗菌制劑。本研究以一株臨床分離的豬源大腸桿菌為宿主菌,從污水中分離純化到一株烈性噬菌體,命名為ECGD1。用磷鎢酸負染法觀察其形態(tài),并進一步測定其最佳感染復數(shù)及宿主譜。對ECGD1進行全基因序列測定,利用生物信息學軟件進行基因預測和功能注釋,并通過全基因組序列比對分析ECGD1與相關噬菌體的進化關系。通過基因組學分析,預測ECGD1裂解酶基因,利用基因工程手段進行體外表達,并進一步鑒定表達產(chǎn)物的裂解活性及與多粘菌素B的協(xié)同抑菌效果。結果顯示:(1)大腸桿菌噬菌體ECGD1可形成透明、邊緣清晰的噬菌斑;電鏡下觀察到ECGD1具有典型的二十面體頭部和伸縮性的尾部,尾部附有一簇尾絲,屬于有尾噬菌體目,肌尾噬菌體科;最佳感染復數(shù)為10-3;通過宿主譜測定,發(fā)現(xiàn)ECGD1是一株寬裂解譜噬菌體,可裂解臨床分離的6株大腸桿菌(6/12)和17株沙門氏菌(17/26),同時還可裂解大腸桿菌基因工程菌株DH5α和BL21。(2)通過基因組測序及分析,發(fā)現(xiàn)ECGD1基因組全長146 647 bp,平均GC含量為37.5%,包含11個tRNA和2個pseudo-tRNA基因;共預測出234個CDS,78個被賦予假定的功能,另外156個功能未知。已賦予功能的CDS,可分為核苷酸代謝/DNA復制/重組、基因組包裝、結構蛋白基因、裂解基因和其它功能基因等五大類;全基因組比對發(fā)現(xiàn),ECGD1與大腸桿菌噬菌體phi92同源性很高,屬于rv-5 like屬的成員。(3)本試驗成功構建了表達裂解酶的重組質(zhì)粒pET-32a-lysin,在BL21(DE3)中成功表達出了裂解酶重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析該表達產(chǎn)物主要為可溶性蛋白,且表達量較高;經(jīng)過活性鑒定,發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有菌內(nèi)及菌外裂解活性;且該重組蛋白與多粘菌素B的聯(lián)用降低了多粘菌素B的最低抑菌濃度。綜上所述,本研究分離的ECGD1是肌尾噬菌體科rv-5 like屬的成員,是一株寬裂解譜的噬菌體,且經(jīng)體外表達的裂解酶初步鑒定具有殺菌效果,因此,噬菌體ECGD1及其裂解酶在大腸桿菌和沙門氏菌感染的防控上具有潛在的應用價值。
【關鍵詞】：大腸桿菌 沙門氏菌 噬菌體 基因組學 裂解酶
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞7-11
• 1 前言11-16
• 1.1 大腸桿菌簡介11
• 1.2 沙門氏菌簡介11-12
• 1.3 噬菌體及噬菌體治療12-13
• 1.4 噬菌體裂解酶及裂解酶治療13-15
• 1.5 本研究目的與意義15-16
• 2 材料與方法16-29
• 2.1 試驗材料16-18
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒16
• 2.1.2 主要試劑與藥品16-17
• 2.1.3 主要儀器設備17-18
• 2.2 噬菌體的分離、鑒定及部分生物學特性分析18-19
• 2.2.1 噬菌體的分離純化18
• 2.2.2 噬菌體形態(tài)的電鏡觀察18
• 2.2.3 噬菌體懸液效價的測定18-19
• 2.2.4 噬菌體ECGD1的最佳感染復數(shù)的測定19
• 2.2.5 噬菌體宿主范圍的測定19
• 2.3 噬菌體ECGD1的基因組學分析19-22
• 2.3.1 噬菌體擴繁濃縮及基因組的提取19-20
• 2.3.2 噬菌體全基因組測序20
• 2.3.3 噬菌體功能基因組學分析20-21
• 2.3.4 裂解酶基因編碼蛋白的結構預測21-22
• 2.4 噬菌體ECGD1裂解酶lysin的表達及活性鑒定22-29
• 2.4.1 裂解酶基因lysin的引物設計和基因擴增22
• 2.4.2 裂解酶基因PCR產(chǎn)物回收22-23
• 2.4.3 裂解酶基因PCR產(chǎn)物與pET-32a的雙酶切23
• 2.4.4 裂解酶基因PCR產(chǎn)物與pET-32a的雙酶切產(chǎn)物的連接23-24
• 2.4.5 重組質(zhì)粒pET-32a-lysin的制備24-25
• 2.4.6 重組質(zhì)粒pET-32a-lysin轉化BL21（DE3）感受態(tài)細胞25
• 2.4.7 目的蛋白的誘導表達25
• 2.4.8 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析25-26
• 2.4.9 目的蛋白的純化及濃度測定26-27
• 2.4.10 表達產(chǎn)物裂解活性的檢測27-28
• 2.4.10.1 菌內(nèi)裂解活性的檢測27
• 2.4.10.2 菌外裂解活性的檢測27-28
• 2.4.11 表達產(chǎn)物裂解譜的測定28
• 2.4.12 多粘菌素B與重組蛋白聯(lián)用裂解活菌28-29
• 3 結果與分析29-57
• 3.1 噬菌體分離、鑒定及部分生物學特性29-32
• 3.1.1 噬菌體分離29
• 3.1.2 噬菌體ECGD1的形態(tài)29-30
• 3.1.3 噬菌體ECGD1效價測定30-31
• 3.1.4 噬菌體ECGD1的最佳感染復數(shù)（MOI）31
• 3.1.5 噬菌體ECGD1的宿主范圍31-32
• 3.2 噬菌體ECGD1全基因組序列測定及分析32-48
• 3.2.1 噬菌體基因組一般特性分析32
• 3.2.2 噬菌體基因組tRNA分析32-33
• 3.2.3 噬菌體基因組基因預測與功能注釋33-44
• 3.2.3.1 核苷酸代謝/DNA復制/重組相關基因34-43
• 3.2.3.2 基因組包裝相關基因43
• 3.2.3.3 結構蛋白基因43
• 3.2.3.4 裂解基因43
• 3.2.3.5 其它功能基因43
• 3.2.3.6 有害基因篩查結果43-44
• 3.2.4 噬菌體基因組比較分析44-45
• 3.2.5 裂解酶基因編碼蛋白的結構預測結果45-48
• 3.2.5.1 結構域預測45
• 3.2.5.2 跨膜區(qū)域預測45-46
• 3.2.5.3 信號肽預測46-47
• 3.2.5.4 二級結構預測結果47
• 3.2.5.5 三級結構預測結果47-48
• 3.3 噬菌體ECGD1裂解酶lysin的表達及活性鑒定48-57
• 3.3.1 裂解酶基因lysin的PCR擴增及重組質(zhì)粒的鑒定48-49
• 3.3.2 裂解酶lysin誘導表達的SDS-PAGE分析49-51
• 3.3.3 裂解酶lysin純化51
• 3.3.4 裂解酶lysin裂解活性鑒定51-54
• 3.3.4.1 裂解酶lysin菌內(nèi)裂解活性檢測51-52
• 3.3.4.2 裂解酶lysin菌外裂解活性檢測52-54
• 3.3.5 裂解酶lysin裂解譜測定54-56
• 3.3.6 裂解酶lysin與多粘菌素B協(xié)同作用效果56-57
• 4 討論57-63
• 4.1 噬菌體生物學特性的探討57-58
• 4.2 噬菌體基因組學探討58-60
• 4.3 裂解酶表達的探討60-61
• 4.4 裂解酶活性鑒定的探討61-62
• 4.5 裂解酶與多粘菌素B協(xié)同作用的探討62-63
• 5 結論63-64
• 致謝64-65
• 參考文獻65-70
• 碩士期間所獲獎勵與發(fā)表文章70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 任慧婧;譚艾娟;呂世明;劉蕓;劉玉梅;張家俊;胡美忠;;市售雞肉中沙門氏菌的污染及耐藥性研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2016年03期

2 江萍;夏利寧;蘇戰(zhàn)強;林亞軍;;規(guī)�；B(yǎng)殖場豬糞源沙門氏菌的耐藥性調(diào)查[J];中國農(nóng)學通報;2015年35期

3 王崔巖;郭月玲;彭亮;仲偉潭;;多粘菌素B研究進展[J];煤炭與化工;2014年08期

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本文編號：615965