本文關(guān)鍵詞：小鼠綠膿桿菌和仙臺病毒LAMP檢測方法的建立及其初步應(yīng)用

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【摘要】：實驗動物是生命科學(xué)研究中最基本的四大支撐要素之一,動物實驗科學(xué)研究的重復(fù)性和準(zhǔn)確性要有實驗動物的質(zhì)量作保障。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究和生命科學(xué)研究中,小鼠是最常用的實驗動物,其微生物質(zhì)量將直接影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)GB14922.2-2011規(guī)定,小鼠綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是無特定病原體(specific pathogen free animal,SPF)實驗小鼠的必須檢測的項目之一;仙臺病毒(Sendai virus,SeV)是清潔級實驗小鼠的必須檢測的項目之一。目前,已經(jīng)報道的檢測小鼠綠膿桿菌和仙臺病毒的方法有:分離培養(yǎng)、RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunoabsorbent Assay,ELISA)等。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法準(zhǔn)確性高,但該方法操作繁瑣、費力、耗時,且檢出率低,易出現(xiàn)假陰性。RT-PCR和ELISA檢測方法靈敏度高,但該方法對儀器要求較高,易出現(xiàn)假陽性。本研究應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),分別根據(jù)小鼠綠膿桿菌和仙臺病毒基因組的高度保守序列,采用PrimerExpler V4軟件設(shè)計LAMP的6條特異性引物,通過優(yōu)化其反應(yīng)體系條件,分別建立了小鼠綠膿桿菌LAMP檢測方法和小鼠仙臺病毒lamp檢測方法,并對其方法的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏度依次進(jìn)行驗證,且初步應(yīng)用于臨床檢測。本研究主要有兩部分組成。第一部分小鼠綠膿桿菌lamp檢測方法的建立及其初步應(yīng)用目的建立一種實驗小鼠綠膿桿菌(pa)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(lamp)檢測方法。方法采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(lamp)技術(shù),以小鼠pa的oprl基因的序列為靶基因,采用primerexploerv4軟件設(shè)計了兩套lamp引物,其中每套引物包含6條特異性序列,應(yīng)用dna提取試劑盒提取padna,通過優(yōu)化lamp反應(yīng)體系條件建立小鼠pa特異性的lamp檢測方法(pa/lamp)。同時,對該方法的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏度進(jìn)行驗證,并初步應(yīng)用于臨床檢測。結(jié)果所建立的pa/lamp方法可特異性的檢測出pa/dna,對其它常見病原體均為陰性;pa/lamp能檢測出不同批次同一時間或同一批次不同時間的pa/dna;pa/lamp檢測pa/dna的最低檢測含量為0.29pg,與pcr檢測方法相比較,其靈敏度高約105倍;臨床檢測,pa的陽性率為27.7%(10/36);全部反應(yīng)可在1h內(nèi)完成;通過添加熒光染料sybrgreeni可直觀目測實驗結(jié)果。結(jié)論建立的pa/lamp方法,具有特異、準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡便的特點,可用于實驗小鼠pa的快速檢測。第二部分小鼠仙臺病毒lamp檢測方法的目的建立一種實驗小鼠仙臺病毒(sev)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)檢測方法。方法采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù),以小鼠SeV(gi:9627219)F蛋白的基因序列為目標(biāo)基因,采用PrimerExploer V4軟件設(shè)計LAMP的6條特異性引物,應(yīng)用病毒RNA提取試劑盒提取SeV RNA,通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系條件,建立小鼠SeV的LAMP檢測方法(SeV/LAMP)。同時,對該方法的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏度進(jìn)行驗證,并初步應(yīng)用于臨床檢測。結(jié)果所建立的SeV/LAMP方法可檢測出SeV RNA,對其它常見病原體均判為陰性;SeV/LAMP能檢測出不同批次同一時間或同一批次不同時間的SeV RNA;SeV/LAMP檢測SeV RNA的最低檢測含量為0.33 pg,與ELISA檢測方法相比較,其檢出率高(分別為5/30和2/30);臨床檢測,SeV的陽性率為27.5%(11/40);全部反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成;通過添加熒光染料SYBR Green I可直觀目測實驗結(jié)果。結(jié)論建立的LAMP方法,具有特異、準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡便的特點,可用于實驗小鼠SeV的快速檢測。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 小鼠 綠膿桿菌 仙臺病毒
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.91
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 小鼠綠膿桿菌LAMP檢測方法的建立及其初步應(yīng)用15-36
• 1 材料16
• 2 方法16-21
• 3 結(jié)果21-32
• 4 討論32-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 第二部分 小鼠仙臺病毒LAMP檢測方法的建立及其初步應(yīng)用36-49
• 1 材料36-37
• 2 方法37-39
• 3 結(jié)果39-45
• 4 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 全文總結(jié)49-50
• 文獻(xiàn)綜述50-60
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 致謝60-61
• 發(fā)表的論文、參與的科研項目及學(xué)術(shù)會議61

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本文編號：608507