本文關(guān)鍵詞：抗菌肽Caerin1.1抑制豬流行性腹瀉病毒增殖的研究

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【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染可造成各年齡段豬群發(fā)生腹瀉、消瘦,感染仔豬死亡率可達(dá)80%~100%,急需有效藥物用于特異性防控,但目前該病以免疫預(yù)防為主,沒有合適且高效的藥物。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)是動(dòng)植物在天然免疫中產(chǎn)生的小分子多肽,有廣譜抗微生物活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道抗菌肽對(duì)囊膜病毒的感染、增殖有較好的抑制作用,但未見其具體對(duì)豬流行性腹瀉病毒的作用研究。本研究探索了本實(shí)驗(yàn)室合成的五種抗菌肽對(duì)PEDV的體外抑制效果,篩選出抗病毒活性較高的抗菌肽Caerin1.1,研究了其抗病毒活性和機(jī)制,主要結(jié)果如下:1.確定不同抗菌肽的抗病毒活性和細(xì)胞毒性分別用5種抗菌肽(Caerin1.1,Piscidin1,Maculatin1.1,Lactoferricin B,Indolicidin等)與PEDV孵育,測(cè)定TCID50。結(jié)果顯示Caerin1.1與Piscidin1抑制效果顯著,且Caerin1.1優(yōu)于Piscidin1。在抗菌肽濃度低于110μg/m L的條件下,二者細(xì)胞毒性都很小,細(xì)胞相對(duì)活力均可達(dá)到80%以上,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)良好,因此后續(xù)研究中所用的抗菌肽濃度均處于安全范圍內(nèi)。2.Caerin1.1孵育條件及抑制效果探索分別設(shè)置孵育溫度和孵育時(shí)間梯度,孵育后倍比稀釋并接種Vero細(xì)胞,測(cè)定病毒TCID50,結(jié)果發(fā)現(xiàn),最佳孵育條件為37℃孵育1h。Caerin1.1和Piscidin1對(duì)PEDV的抑制效果顯著,但兩者沒有協(xié)同作用。Caerin1.1對(duì)3個(gè)不同PEDV毒株的抑制效果均十分顯著且呈劑量依賴,PEDV-YN株病毒滴度可從10-4.5下降至10-1.5。3.抗菌肽Caerin1.1直接殺傷病毒,發(fā)揮其抗病毒作用設(shè)置抗菌肽與病毒作用的3個(gè)不同方式,即Caerin1.1與細(xì)胞提前孵育1h后接種PEDV;Caerin1.1與PEDV孵育1h后接種于細(xì)胞;細(xì)胞先接種PEDV 1h后加入Caerin1.1。測(cè)定TCID50,繪制生長曲線,結(jié)果表明Caerin1.1與病毒提前孵育時(shí)病毒滴度下降最多,其他兩種處理方式時(shí),PEDV滴度僅有一定程度下降,說明Caerin1.1發(fā)揮作用的主要階段在與病毒直接孵育的過程。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),抗菌肽和病毒孵育后破壞病毒囊膜完整性,Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),抗菌肽和病毒直接孵育后感染細(xì)胞,PEDV-N蛋白表達(dá)量顯著下降,說明病毒感染細(xì)胞的能力下降,增殖被抑制。4.吸附入侵及釋放階段抑制效果探索通過增加4℃孵育時(shí)間,分別延長PEDV吸附和入侵細(xì)胞時(shí)間,隨后加入Caerin1.1,孵育3h后棄去含抗菌肽的培養(yǎng)基,結(jié)果顯示即使Caerin1.1濃度增加,病毒的滴度與病毒對(duì)照相比仍無顯著差異,說明Caerin1.1對(duì)PEDV入侵和吸附宿主細(xì)胞的過程無抑制效果。病毒侵入細(xì)胞后(接毒1h后)加入抗菌肽,分別測(cè)定上清病毒和胞內(nèi)病毒滴度,結(jié)果顯示抗菌肽處理組的胞內(nèi)病毒滴度與病毒對(duì)照組胞內(nèi)病毒滴度無顯著差異,說明病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和組裝并未受到抑制;而上清中PEDV的滴度有顯著下降,且毒價(jià)上升趨勢(shì)延緩,說明Caerin1.1可抑制病毒釋放。對(duì)Caerin1.1進(jìn)行FITC標(biāo)記,細(xì)胞內(nèi)定位結(jié)果顯示Caerin1.1定位在細(xì)胞質(zhì);在無PEDV感染的對(duì)照組細(xì)胞中,Caerin1.1呈隨機(jī)散在分布狀態(tài),而在PEDV感染的細(xì)胞中,Caerin1.1則呈聚集狀態(tài),與病毒的分布狀況高度一致。綜上所述,我們篩選出能有效抑制PEDV增殖的抗菌肽Caerin1.1和Piscidin1。發(fā)現(xiàn)Caerin1.1主要破壞病毒囊膜抑制病毒增殖,但也抑制病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放。研究結(jié)果為防控PED提供了新的生物制劑。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽Caerin1.1 豬流行性腹瀉病毒 抗病毒活性 抑制機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 縮略語表(Abbreviation)11-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 豬流行性腹瀉疾病概述12-17
• 1.1.1 病原學(xué)特點(diǎn)12-14
• 1.1.2 流行病學(xué)特征14
• 1.1.3 臨床癥狀及病理變化14-15
• 1.1.4 診斷及防治15-17
• 1.1.5 抗PEDV的藥物17
• 1.2 抗菌肽研究進(jìn)展17-23
• 1.2.1 簡(jiǎn)介及分類17-19
• 1.2.2 抗菌活性及作用機(jī)制19
• 1.2.3 抗病毒和抗腫瘤活性的研究進(jìn)展19-21
• 1.2.4 應(yīng)用現(xiàn)狀及潛力21-22
• 1.2.5 抗菌肽Caerin的研究概況22-23
• 第2章 目的與意義23-24
• 第3章 材料與方法24-34
• 3.1 材料24-26
• 3.1.1 毒株、細(xì)胞及抗菌肽24
• 3.1.2 主要儀器與耗材24-25
• 3.1.3 主要試劑25
• 3.1.4 主要溶液的配制25-26
• 3.2 方法26-34
• 3.2.1 抗菌肽初步篩選26
• 3.2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)26-27
• 3.2.3 抗菌肽聯(lián)合作用27
• 3.2.4 Caerin1.1 時(shí)效觀察27-28
• 3.2.5 Caerin1.1 抗病毒活性的劑量依賴28
• 3.2.6 Caerin1.1 作用條件28-29
• 3.2.7 Caerin1.1 對(duì)PEDV的抑制效果29
• 3.2.8 Caerin1.1 抗病毒作用機(jī)制29-31
• 3.2.9 Caerin1.1 對(duì)PEDV的直接殺傷效果31
• 3.2.10 Caerin1.1 對(duì)病毒吸附入侵階段的影響31-32
• 3.2.11 Caerin1.1 對(duì)病毒組裝釋放階段的影響32-33
• 3.2.12 Caerin1.1 的細(xì)胞內(nèi)定位33-34
• 第4章 結(jié)果與分析34-46
• 4.1 抗菌肽對(duì)PEDV的抑制效果34-40
• 4.1.1 各抗菌肽對(duì)PEDV-YN株的抑制效果34
• 4.1.2 細(xì)胞毒性分析34-35
• 4.1.3 聯(lián)合作用抗病毒效果35-37
• 4.1.4 溫度對(duì)Caerin1.1 時(shí)效的影響37
• 4.1.5 Caerin1.1 抗病毒活性的劑量依賴37-38
• 4.1.6 Caerin1.1 與PEDV的最適孵育條件38-39
• 4.1.7 Caerin1.1 對(duì)PEDV其它毒株的抑制效果39-40
• 4.2 Caerin1.1 對(duì)PEDV的抑制機(jī)制40-46
• 4.2.1 不同時(shí)間點(diǎn)的抑制效果40-42
• 4.2.2 對(duì)PEDV的直接殺傷效果驗(yàn)證42
• 4.2.3 對(duì)PEDV吸附入侵階段的影響42-44
• 4.2.4 對(duì)PEDV增殖釋放階段的影響44-45
• 4.2.5 在Vero細(xì)胞內(nèi)的定位45-46
• 第5章 討論與結(jié)論46-50
• 5.1 討論46-49
• 5.1.1 不同抗菌肽對(duì)PEDV抑制效果差異分析46-47
• 5.1.2 Caerin1.1 抑制PEDV的機(jī)制47-48
• 5.1.3 抗菌肽的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用前景48-49
• 5.2.結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-60
• 附錄60-62
• 致謝62

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳潤;邢麗麗;郝葆青;宋慧;;抗菌肽的研究進(jìn)展[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年S1期

2 張召兄;潘曉亮;任耀軍;;抗菌肽概述及抗菌分子機(jī)理的研究進(jìn)展[J];草食家畜;2006年04期

3 李明魁;郭菊;張遂平;;抗菌肽的研究與應(yīng)用[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2007年01期

4 張?zhí)m廷;劉忠淵;張富春;;抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及分子改造研究進(jìn)展[J];生物技術(shù);2008年05期

5 廖世奇;周思彤;曾家豫;;生物抗菌肽的研究進(jìn)展[J];甘肅醫(yī)藥;2009年01期

6 譚顯勝;李巍巍;王志明;袁哲明;;抗菌肽的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年16期

7 李書偉;晏家友;;抗菌肽的研究進(jìn)展[J];四川畜牧獸醫(yī);2010年05期

8 朱鑫;馬清泉;董娜;單安山;;改良型抗菌肽的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2012年09期

9 蔡靈;;抗菌肽來源及其應(yīng)用進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年13期

10 梁世德,張士璀;抗菌肽和抗菌肽基因[J];海洋科學(xué);1994年06期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐家萍;王成林;楊瑩;尤征英;;多功能抗菌肽及其分子改造的研究進(jìn)展[A];華東·華中地區(qū)第十二次蠶種學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 孫振鈞;;蚯蚓抗菌肽研究進(jìn)展[A];畜牧業(yè)環(huán)境、生態(tài)、安全生產(chǎn)與管理——2010年家畜環(huán)境與生態(tài)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

3 尚德靜;白冰;李曉帆;付欣;鄭俊杰;;中國林蛙(Rana chensinensis)皮膚抗菌肽基因和功能多樣性研究[A];“基因、進(jìn)化與生理功能多樣性”海內(nèi)外學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國生理學(xué)會(huì)第七屆比較生理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2009年

4 黃自然;黃亞東;溫劉發(fā);鄭青;廖富頻;胡建雄;黃國慶;姜麗華;黃永彤;李運(yùn)南;梁淑娃;彭中建;董加喜;夏楓耿;陳松彬;;抗菌肽生物工程及其應(yīng)用[A];全國桑樹種質(zhì)資源及育種和蠶桑綜合利用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

5 廖富，

本文編號(hào)：607718