本文關(guān)鍵詞：貴州省畜禽主要病原菌耐藥性及耐藥基因研究

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【摘要】：隨著我國畜禽集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展,畜禽病原菌的耐藥性問題日益突出。由于抗菌藥物的不合理使用,使得耐藥菌株不斷涌現(xiàn),多重耐藥現(xiàn)象不斷惡化,耐藥機制愈加復(fù)雜,這給畜禽細菌病臨床治療帶來了很大的困難,嚴重威脅著公共衛(wèi)生安全,也給新藥開發(fā)帶來了巨大的壓力。貴州省有關(guān)畜禽細菌耐藥性系統(tǒng)研究鮮有報道,本研究擬在分析研究資料和調(diào)查報告的基礎(chǔ)上,開展貴州省畜禽主要病原細菌的快速檢測技術(shù)、耐藥表型和基因型、耐藥基因序列進化特征等相關(guān)研究,對深入探討細菌耐藥性分子機制具有理論意義。1.貴州省畜禽源主要病原細菌流行病學(xué)研究:通過對貴州省2008~2014年間研究資料、調(diào)查報告進行統(tǒng)計分析,分別從時間分布、動物類別分布、地域分布等方面對畜禽養(yǎng)殖場細菌性疫病流行特點進行分析,并對畜禽細菌病臨床病例的防控情況進行調(diào)查分析。結(jié)果顯示:此間貴州省畜禽細菌性疫病主要以大腸埃希氏菌病、葡萄球菌病、鏈球菌病、巴氏桿菌病和沙門氏菌病為主;發(fā)病呈一定的季節(jié)性,每年5~9月為高發(fā)期,10~12月為低發(fā)期,細菌性疫病發(fā)生主要以羊為主,其余依次是豬、牛、禽等;各地細菌病發(fā)病例數(shù)存在一定差異,其中銅仁市各種主要細菌性疫病的病例數(shù)高于其他地區(qū),細菌性疫病免疫防控率較低,免疫率在2.3%~20.6%之間,主要防控方式依然是抗菌藥防控。養(yǎng)殖場最常用的抗菌藥物有β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)脂類和喹諾酮類抗菌藥物,其中β-內(nèi)酰胺類使用最為頻繁。2.畜禽主要病原菌多重PCR方法的建立與應(yīng)用:針對貴州省主要流行病原菌(大腸埃希氏菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鏈球菌、葡萄球菌實驗室前期分離,進行過相關(guān)致病性研究)設(shè)計合成引物,構(gòu)建PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,并評估多重PCR方法的性能,對研究所需的分離菌株進行復(fù)檢分析。結(jié)果顯示:所設(shè)計的各種細菌PCR引物均能有效擴增目的基因,其中擴增出的大腸埃希菌23S r RNA基因、巴氏桿菌KMT基因、沙門氏菌inv A基因、葡萄球菌的nuc基因和鏈球菌的EF-TU基因片段大小分別為663 bp、456 bp、284 bp、500 bp和197 bp。構(gòu)建能同時檢測葡萄球菌和鏈球菌的雙重PCR最佳反應(yīng)條件為:葡萄球菌和鏈球菌的引物濃度分別為0.5μmol/L和0.5μmol/L,退火溫度為54℃;在此條件下同時檢測葡萄球菌和鏈球菌的敏感性分別是1.50 ng/μL和1.44 ng/μL。構(gòu)建能同時檢測大腸埃希氏菌、沙門氏菌和巴氏桿菌的三重PCR最佳反應(yīng)條件為:大腸埃希氏菌、巴氏桿菌和沙門氏菌的引物濃度分別為1.0μmol/L、1.5μmol/L和1.0μmol/L,退火溫度為56℃;在此條件下同時檢測大腸埃希氏菌、巴氏桿菌和沙門氏菌的敏感性分別是114.00 pg/μL、1.50 ng/μL和1.44 ng/μL。對147株臨床分離菌株的檢測顯示,雙重PCR和三重PCR檢測結(jié)果與生化鑒定結(jié)果的符合率分別為97.26%和98.72%,結(jié)果表明所建立的PCR方法檢測結(jié)果跟傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果高度一致。3.畜禽主要病原細菌耐藥表型和耐藥基因型研究:隨機選取畜禽5種病原菌共151株,應(yīng)用K-B法對5類21種抗菌藥對其進行藥物敏感性實驗,并針對β-內(nèi)酰胺類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)脂類耐藥基因、鏈霉素耐藥基因和磺胺類耐藥基因設(shè)計合成了23對特異性引物,檢測各種細菌耐藥相關(guān)基因,分析細菌耐藥表型和耐藥基因型相關(guān)性。結(jié)果顯示:所有供試菌株均表現(xiàn)出明顯的耐藥性,總耐藥率在54.42%~93.20%之間,多重耐藥主要集中耐6-11種藥物之間。在選取的21種抗生素中,以青霉素、阿莫西林、鏈霉素和磺胺甲基異惡唑的抑菌效果較差;23個耐藥基因共檢出19個,檢出率最高的是大腸埃希氏菌喹諾酮類aac(6’)-Ib-cr,為77.59%。介導(dǎo)我省大腸埃希氏菌對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是sul1、對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是aac(6’)-Ib-cr,對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是TEM;介導(dǎo)我省巴氏桿菌對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是sul2、對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是Str A;介導(dǎo)我省沙門氏菌對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是sul2、對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是Str A;介導(dǎo)我省葡萄球菌對大環(huán)類脂類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是erm B,對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是bla Z;介導(dǎo)我省鏈球菌對大環(huán)類脂類藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是erm B;通過對151株臨床分離株耐藥表型和耐藥基因相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:細菌對鏈霉素耐藥的耐藥基因跟耐藥表型的符合率最高,為100%,巴氏桿菌對磺胺類藥物的耐藥表型與耐藥基因型的符合率最低,為71.43%。4.畜禽主要病原細菌耐藥相關(guān)基因序列分析:應(yīng)用分子克隆技術(shù)對各種細菌主要耐藥基因進行克隆及測序,應(yīng)用Meg Align軟件對測序序列進行同源性、基因一致性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示:除大腸埃希氏菌aac(6’)-Ib-cr基因、巴氏桿菌gyr A和par C基因、鏈球菌gyr A和par C基因存在較多變異外,其他耐藥基因均表現(xiàn)出較高的保守性,其中最保守的是大腸桿菌CTX-M基因、巴氏桿菌sul2基因和鏈球菌mef A基因,與國內(nèi)外參考菌株的序列同源性均為100%。結(jié)論:1.貴州省畜禽細菌病主要病原菌為大腸埃希氏菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和鏈球菌;細菌病發(fā)生存在時間和地域差異。2.建立可快速鑒定大腸埃希氏菌、沙門氏菌、巴氏桿菌的三重PCR方法和葡萄球菌、鏈球菌的雙重PCR方法,二者對臨床分離株的檢測結(jié)果與生化試驗鑒定結(jié)果符合率高。3.貴州省畜禽五種主要病原細菌存在廣泛耐藥,耐藥基因種類多樣,耐藥表型和耐藥基因型高度統(tǒng)一。4.貴州省畜禽五種主要病原細菌耐藥基因相對保守,部分耐藥基因存在點突變。
【關(guān)鍵詞】：畜禽細菌病 耐藥性 耐藥表型 耐藥基因 序列分析
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.6
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-14
• 文獻綜述 畜禽主要病原菌及其耐藥機制研究進展14-24
• 第一章 貴州省畜禽源主要病原細菌流行病學(xué)研究24-35
• 1 材料和方法24
• 1.1 材料24
• 1.2 方法24
• 2 結(jié)果24-33
• 2.1 畜禽細菌性疫病流行情況調(diào)查24-29
• 2.2 畜禽細菌病防控情況調(diào)查29-33
• 3 討論33-35
• 3.1 關(guān)于畜禽主要細菌性疫病33
• 3.2 關(guān)于細菌性疫病防控藥物選擇33-34
• 3.3 關(guān)于細菌病的混合感染現(xiàn)狀34-35
• 第二章 五種病原菌快速鑒別PCR方法的建立與應(yīng)用35-52
• 1 材料35-36
• 1.1 菌株35
• 1.2 培養(yǎng)基35
• 1.3 革蘭氏染色試劑35
• 1.4 主要分子生物學(xué)試劑35-36
• 1.5 試驗儀器36
• 2 方法36-41
• 2.1 細菌培養(yǎng)36
• 2.2 單重PCR方法的建立及敏感性檢測36-38
• 2.3 多重PCR方法的建立及條件優(yōu)化38-41
• 2.4 多重PCR方法的臨床應(yīng)用與分離菌株的檢測41
• 3 結(jié)果與分析41-50
• 3.1 單重PCR方法的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化41-43
• 3.2 多重PCR方法建立43-49
• 3.3 多重PCR方法的臨床應(yīng)用及分離菌株復(fù)檢結(jié)果49-50
• 4 討論50-52
• 4.1 關(guān)于畜禽病原細菌鑒定技術(shù)50
• 4.2 關(guān)于畜禽病原細菌鑒定的多重PCR引物50-51
• 4.3 關(guān)于畜禽病原細菌多重PCR技術(shù)關(guān)鍵因素51-52
• 第三章 貴州省畜禽主要病原菌耐藥表型與耐藥基因型研究52-83
• 1 材料52-53
• 1.1 實驗菌株52
• 1.2 主要試劑52
• 1.3 藥敏紙片52-53
• 1.4 實驗儀器53
• 2 方法53-56
• 2.1 抗菌藥物藥物敏感性實驗53
• 2.2 畜禽主要病原菌相關(guān)耐藥基因檢測53-56
• 3 結(jié)果與分析56-81
• 3.1 大腸埃希氏菌耐藥性與耐藥基因檢測結(jié)果56-62
• 3.2 巴氏桿菌耐藥性與耐藥基因檢測結(jié)果62-66
• 3.3 沙門氏菌耐藥性與耐藥基因檢測結(jié)果66-70
• 3.4 葡萄球菌耐藥性與耐藥基因檢測結(jié)果70-75
• 3.5 鏈球菌耐藥性與耐藥基因檢測結(jié)果75-81
• 4 討論81-83
• 4.1 關(guān)于細菌耐藥表型檢測81
• 4.2 關(guān)于細菌耐藥基因檢測81-82
• 4.3 關(guān)于耐藥表型與耐藥基因型的相關(guān)性82-83
• 第四章 貴州省畜禽主要病細菌耐藥基因序列分析83-120
• 1 材料83
• 1.1 實驗菌株83
• 1.2 主要試劑及培養(yǎng)基83
• 1.3 實驗儀器83
• 2 方法83-86
• 2.1 細菌耐藥相關(guān)基因擴增83
• 2.2 細菌耐藥相關(guān)基因克隆83-86
• 2.3 細菌耐藥相關(guān)基因序列測定與分析86
• 3 結(jié)果與分析86-118
• 3.1 大腸埃希氏菌部分耐藥基因序列分析結(jié)果86-97
• 3.2 巴氏桿菌部分耐藥基因序列測定及同源性分析結(jié)果97-102
• 3.3 沙門氏菌耐藥基因序列分析結(jié)果102-106
• 3.4 葡萄球菌耐藥基因序列分析結(jié)果106-113
• 3.5 鏈球菌部分耐藥基因序列測定及同源性分析結(jié)果113-118
• 4 討論118-120
• 4.1 關(guān)于耐藥基因突變分析118
• 4.2 關(guān)于耐藥基因的選擇118-119
• 4.3 關(guān)于細菌耐藥基因決定區(qū)119-120
• 全文結(jié)論120-121
• 主要參考文獻121-133
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文133-134
• 致謝134-135

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9 梁思思;李s，

本文編號：600115