本文關(guān)鍵詞：豬食欲肽受體2激動(dòng)劑細(xì)胞篩選模型的建立及其應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 豬食欲肽受體2 細(xì)胞篩選模型 中藥 提取物

【摘要】：食欲肽(Orexin)是由下丘腦食欲肽能神經(jīng)元分泌的一類神經(jīng)肽,它能夠在大腦不同區(qū)域高效地表達(dá),可對(duì)動(dòng)物的能量平衡進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)。食欲肽是通過(guò)對(duì)應(yīng)的受體即食欲肽受體(OX1R和OX2R)發(fā)揮其功能的,它與動(dòng)物的多種生理功能相關(guān),但是最主要是在攝食與能量平衡上起到的重要作用。cAMP/PKA信號(hào)通路是OXR的經(jīng)典信號(hào)通路,當(dāng)其配體(激動(dòng)劑或拮抗劑)與OXR結(jié)合后,改變細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平,進(jìn)而引起蛋白激酶A (PKA)狀態(tài)的變化,引發(fā)相應(yīng)的生理學(xué)效應(yīng)。目前,雖然關(guān)于OX2R信號(hào)通路方面的研究已有報(bào)道,但在家畜方面的報(bào)道仍比較少,特別是豬,而豬的體重又是重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。同時(shí),有研究表明OX2R是一種非選擇性的受體,可與其匹配的激動(dòng)劑范圍更寬泛一些。但關(guān)于以O(shè)X2R為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型的建立與應(yīng)用方面的研究卻尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在豬OX2R真核表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上,以cAMP水平變化所建立的報(bào)告基因檢測(cè)方法為依據(jù),建立以豬OX2R為靶點(diǎn)的穩(wěn)定、可靠的豬OX2R激動(dòng)劑細(xì)胞篩選模型,對(duì)選取的部分中藥的提取物進(jìn)行篩選,用來(lái)發(fā)現(xiàn)一些其他非內(nèi)源性的激動(dòng)劑,為篩選提高豬的生產(chǎn)效率的先導(dǎo)化合物及相關(guān)藥物的研發(fā)做一些基礎(chǔ)性的研究。主要研究結(jié)果如下：1、將豬OX2R真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-myc/pOX2R與熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]以1：5的比例共轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞,通過(guò)G418 (800μg/ml)和潮霉素B (400μg/ml)進(jìn)行抗性篩選并利用有限稀釋法得到螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)表達(dá)量最高的一株單克隆株作為陽(yáng)性細(xì)胞株；提取其總RNA,RT-PCR后在預(yù)期位置擴(kuò)增出豬OX2R基因(1332bp)的目的條帶,同時(shí),通過(guò)力Foskolin檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)量的變化,證實(shí)了螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的成功轉(zhuǎn)入。2、將pcDNA3.1(+)空載體和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒以1：5的比例按上述方法共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞株,按1方法得到熒光素酶表達(dá)量最高且背景值較低的單克隆株作為陰性細(xì)胞株。同時(shí),通過(guò)轉(zhuǎn)染后加IFoskolin檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)量的變化,證實(shí)了螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的成功轉(zhuǎn)入。陰性細(xì)胞株用于內(nèi)源性受體及假陽(yáng)性激動(dòng)劑的排除。3、對(duì)所選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞篩選模型進(jìn)行條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)當(dāng)激動(dòng)劑OXB終濃度為10-6mol/L,孵育時(shí)間為9h,溶劑DMSO終濃度小于等于3%及檢測(cè)試劑Luciferase AssayReagent用量為原液的1/2時(shí),篩選模型Z因子值為0.85,說(shuō)明建立的篩選方法可靠、穩(wěn)定,可用于OX2R激動(dòng)劑的篩選。4、分別利用醇提法與水提法對(duì)18種天然中藥進(jìn)行有效成分提取,得到36種天然提取物樣品,利用建立的豬OX2R穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行激動(dòng)劑的篩選并利用陰性細(xì)胞株排除了假陽(yáng)性天然提取物樣品,得到本底比大于2的提取物樣品共3種,其中醇提物2種,水提物1種;利用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)得到的3種陽(yáng)性提取物樣品進(jìn)行劑量效應(yīng)關(guān)系的研究,發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi),3種提取物樣品均具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：豬食欲肽受體2 細(xì)胞篩選模型 中藥 提取物
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-30
• 1 食欲肽與其受體11-18
• 1.1 食欲肽與其受體的結(jié)構(gòu)特征和分類11-12
• 1.2 食欲肽B(OXB)及其受體的生理功能12-13
• 1.3 食欲肽及其受體的研究現(xiàn)狀13-16
• 1.4 食欲肽受體2參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制16-18
• 2 高通量藥物篩選18-24
• 2.1 高通量藥物篩選的研究進(jìn)展18-20
• 2.2 基于細(xì)胞模型的高通量藥物篩選20-22
• 2.3 靶向G蛋白偶聯(lián)受體的高通量藥物篩選方法22-24
• 3 天然中藥材提取液的制備24-28
• 3.1 天然中藥材有效成分的提取24-26
• 3.2 天然中藥材有效成分的提取工藝研究進(jìn)展26-27
• 3.3 影響天然中藥材提取效果的因素27-28
• 4 本研究的目的與意義28-30
• 第二章 以豬食欲肽受體2為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型的建立30-50
• 1 材料30-31
• 1.1 主要儀器設(shè)備30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 主要溶液的配制31
• 2 試驗(yàn)方法31-38
• 2.1 CHO-K1細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)與鋪板31-32
• 2.2 穩(wěn)定細(xì)胞株的建立32-34
• 2.3 驗(yàn)證陽(yáng)性細(xì)胞、陰性細(xì)胞中目的基因的表達(dá)34-35
• 2.4 優(yōu)化篩選條件35-36
• 2.5 篩選方法評(píng)估36-37
• 2.6 pOX2R細(xì)胞株內(nèi)源性干擾的檢測(cè)37
• 2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)37
• 2.8 數(shù)據(jù)處理與分析37-38
• 3 結(jié)果與分析38-46
• 3.1 陽(yáng)性及陰性細(xì)胞株的篩選和確定38-40
• 3.2 驗(yàn)證目的基因及螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)入40-42
• 3.3 篩選條件的優(yōu)化結(jié)果42-45
• 3.4 篩選方法的評(píng)估結(jié)果45
• 3.5 豬OX2R陽(yáng)性細(xì)胞株內(nèi)源性干擾的檢測(cè)結(jié)果45-46
• 4 討論46-49
• 4.1 報(bào)告基因的確定46-47
• 4.2 基于pOX2RcAMP/PKA信號(hào)通路的細(xì)胞篩選模型建立的理論依據(jù)47-48
• 4.3 穩(wěn)定細(xì)胞模型的優(yōu)化與評(píng)估原則48-49
• 5 本章小結(jié)49-50
• 第三章 豬食欲肽受體2激動(dòng)劑的細(xì)胞篩選模型的應(yīng)用50-64
• 1 材料50-51
• 1.1 主要儀器設(shè)備50
• 1.2 主要試劑50-51
• 2 試驗(yàn)方法51-54
• 2.1 天然中藥材提取物的制備51-52
• 2.2 pOX2R受體激動(dòng)劑的篩選52-53
• 2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法分析陽(yáng)性提取物的劑量效應(yīng)關(guān)系53-54
• 2.4 數(shù)據(jù)處理與分析54
• 3 結(jié)果與分析54-61
• 3.1 選取的天然中藥材的名稱與提取物濃度54-55
• 3.2 pOX2R受體激動(dòng)劑的篩選結(jié)果55-57
• 3.3 陽(yáng)性提取物的劑量效應(yīng)關(guān)系分析57-61
• 4 討論61-63
• 4.1 天然中藥材的選擇61
• 4.2 天然中藥材提取方法的確定61-62
• 4.3 陽(yáng)性化合物劑量效應(yīng)關(guān)系的探索及其有效成分、作用機(jī)理的探討62-63
• 5 本章小結(jié)63-64
• 全文結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-72
• 致謝72-73
• 在讀期間發(fā)表的文章73-74

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本文編號(hào)：599435