本文關鍵詞：不同來源β-酪蛋白基因啟動子調控人IFNα-2b基因的表達效率

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【摘要】：【目的】為獲得高啟動效率的乳腺特異啟動子,對荷斯坦奶牛、娟姍牛和奶水牛的β-酪蛋白基因啟動子進行比較研究�！痉椒ā繉enbank中所收錄的荷斯坦奶牛、娟姍牛和水牛β-酪蛋白基因啟動子序列進行比對分析,按照保守序列分別設計啟動子區(qū)和3′端ploy A序列引物,同時設計人IFNα-2b基因和EGFP-Neo篩選序列引物并引入預先設計的酶切位點以方便載體構建。采集靜脈血液,提取基因組DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因啟動子區(qū)和3′端ploy A區(qū),同時以實驗室保存質粒為模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo篩選序列。測序正確后,將各片段按設計順序依次插入p MD18-T骨架中,構建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特異表達載體。將各載體轉染Bcap-37細胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定整合的轉基因細胞系。用胰島素(1 mg·L-1),轉鐵蛋白因子(1 mg·L-1),氫化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)聯(lián)合對轉基因細胞系進行誘導,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技術和ELISA方法分別在m RNA水平和蛋白質水平檢測IFNα-2b的表達�！窘Y果】PCR后獲得了荷斯坦奶牛、娟姍牛和水牛β-酪蛋白基因啟動子區(qū),長度分別為5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外顯子,第一內含子和部分第二外顯子,部分第二外顯子的51個堿基編碼17個氨基酸的信號肽序列�？寺×�1 166 bp的ploy A區(qū)序列。最終將構建的3個乳腺特異表達載體轉染Bcap-37細胞并經(jīng)過G418篩選后,獲得了3個轉基因細胞系。經(jīng)激素誘導后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)3個轉基因細胞系都表達了IFNα-2b基因,并且發(fā)現(xiàn)娟姍牛β-酪蛋白基因啟動子在調控IFNα-2b基因的表達上效率較高,在m RNA水平和蛋白質水平上顯著高于其他兩個啟動子(P0.05)�！窘Y論】娟姍牛β-酪蛋白基因啟動子在調控外源基因表達上具有較高的效率,是具有應用前景的乳腺特異性啟動子。所構建的表達載體為IFNα-2b轉基因動物乳腺生物反應器的制備奠定基礎。
【作者單位】： 廣西大學動物科學技術學院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室;江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所/動物品種改良與繁育重點實驗室;
【關鍵詞】： 啟動子 娟姍牛 干擾素α-b Bcap- 轉基因
【基金】：國家“863”項目(2011AA100607) 國家轉基因專項(2014ZX08007001-002)
【分類號】：S823
【正文快照】： 0前言【研究意義】轉基因動物乳腺生物反應器中的乳腺特異表達啟動子一般由乳蛋白啟動子來承擔。為使外源蛋白高效表達,在乳腺特異表達載體的設計中,啟動子的選擇至關重要。【前人研究進展】乳蛋白啟動子的特異性由啟動子區(qū)中激素調節(jié)等相關元件來決定[1]。其中主要的特異性相

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