本文關(guān)鍵詞：不同來(lái)源β-酪蛋白基因啟動(dòng)子調(diào)控人IFNα-2b基因的表達(dá)效率

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【摘要】：【目的】為獲得高啟動(dòng)效率的乳腺特異啟動(dòng)子,對(duì)荷斯坦奶牛、娟姍牛和奶水牛的β-酪蛋白基因啟動(dòng)子進(jìn)行比較研究。【方法】對(duì)Genbank中所收錄的荷斯坦奶牛、娟姍牛和水牛β-酪蛋白基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析,按照保守序列分別設(shè)計(jì)啟動(dòng)子區(qū)和3′端ploy A序列引物,同時(shí)設(shè)計(jì)人IFNα-2b基因和EGFP-Neo篩選序列引物并引入預(yù)先設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)以方便載體構(gòu)建。采集靜脈血液,提取基因組DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)和3′端ploy A區(qū),同時(shí)以實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒為模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo篩選序列。測(cè)序正確后,將各片段按設(shè)計(jì)順序依次插入p MD18-T骨架中,構(gòu)建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特異表達(dá)載體。將各載體轉(zhuǎn)染Bcap-37細(xì)胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。用胰島素(1 mg·L-1),轉(zhuǎn)鐵蛋白因子(1 mg·L-1),氫化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)聯(lián)合對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo),然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技術(shù)和ELISA方法分別在m RNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)IFNα-2b的表達(dá)。【結(jié)果】PCR后獲得了荷斯坦奶牛、娟姍牛和水牛β-酪蛋白基因啟動(dòng)子區(qū),長(zhǎng)度分別為5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外顯子,第一內(nèi)含子和部分第二外顯子,部分第二外顯子的51個(gè)堿基編碼17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A區(qū)序列。最終將構(gòu)建的3個(gè)乳腺特異表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Bcap-37細(xì)胞并經(jīng)過(guò)G418篩選后,獲得了3個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。經(jīng)激素誘導(dǎo)后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系都表達(dá)了IFNα-2b基因,并且發(fā)現(xiàn)娟姍牛β-酪蛋白基因啟動(dòng)子在調(diào)控IFNα-2b基因的表達(dá)上效率較高,在m RNA水平和蛋白質(zhì)水平上顯著高于其他兩個(gè)啟動(dòng)子(P0.05)�！窘Y(jié)論】娟姍牛β-酪蛋白基因啟動(dòng)子在調(diào)控外源基因表達(dá)上具有較高的效率,是具有應(yīng)用前景的乳腺特異性啟動(dòng)子。所構(gòu)建的表達(dá)載體為IFNα-2b轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的制備奠定基礎(chǔ)。
【作者單位】： 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/動(dòng)物品種改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 啟動(dòng)子 娟姍牛 干擾素α-b Bcap- 轉(zhuǎn)基因
【基金】：國(guó)家“863”項(xiàng)目(2011AA100607) 國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)(2014ZX08007001-002)
【分類號(hào)】：S823
【正文快照】： 0前言【研究意義】轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器中的乳腺特異表達(dá)啟動(dòng)子一般由乳蛋白啟動(dòng)子來(lái)承擔(dān)。為使外源蛋白高效表達(dá),在乳腺特異表達(dá)載體的設(shè)計(jì)中,啟動(dòng)子的選擇至關(guān)重要。【前人研究進(jìn)展】乳蛋白啟動(dòng)子的特異性由啟動(dòng)子區(qū)中激素調(diào)節(jié)等相關(guān)元件來(lái)決定[1]。其中主要的特異性相

【相似文獻(xiàn)】

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