本文關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒H120型M、N基因的免疫原性研究

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【摘要】：雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一種雞的急性傳染性疾病,通過接觸相互傳染,各年齡的雞都可發(fā)病,該病在世界范圍流行十分廣泛,是侵害養(yǎng)雞業(yè)的最嚴(yán)重的傳染病之一,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為禽病B類傳染病。由于雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)極易發(fā)生變異,經(jīng)常出現(xiàn)新的血清型,并且不同血清型之間交叉感染現(xiàn)象嚴(yán)重,不同毒株之間基本沒有交叉保護力,所以該病的免疫非常困難,雞群內(nèi)呈爆發(fā)式發(fā)生,給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。本研究對IBV H120株基因序列進行分析,將H120株M基因和N基因構(gòu)建到真核表達載體中,并對重組質(zhì)粒的免疫原性進行了研究,為研制IB的DNA疫苗提供依據(jù)。1.從GenBank上下載登錄號為FJ888351.1的IBV H120型的基因序列,并對其基因序列進行分析,IBV基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白主要有3種,其中N蛋白最為保守,與病毒RNA的合成有關(guān),并且N蛋白上有重要的抗原決定簇;而M蛋白的保守性僅次于N蛋白,可能與核衣殼蛋白結(jié)合,決定了病毒的出芽位置,在病毒復(fù)制過程中起一定作用,部分抗原決定簇也在M基因上存在。利用PrimerPremier5.0針對IBV-M和IBV-N基因分別設(shè)計一對引物,采用RT-PCR試驗擴增出具有免疫保護作用的抗原基因M和N基因,通過對這兩個基因的測序進行分析發(fā)現(xiàn),IBV-M基因序列含有大約678個堿基,編碼225個氨基酸;IBV-N基因序列含有大約1230個堿基,編碼410個氨基酸。將其與GenBank上登錄的其他毒株進行比較,發(fā)現(xiàn)其變異性小,同源率很高,其中IBV-M基因與其他毒株核苷酸序列同源性為84.7%~100%之間,相對應(yīng)的氨基酸同源性為86%~100%;IBV-N基因與其他毒株核苷酸序列同源性為90.2%~100%之間,相對應(yīng)的氨基酸同源性為91%~100%之間。2.將擴增出的IBV-M基因和IBV-N基因用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切,亞克隆到pEGFP-C1-SCP-SEC載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,經(jīng)菌落篩選和測序,鑒定出正確的陽性克隆,完成真核表達載體的構(gòu)建。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Vero細胞中,進行免疫熒光試驗,可以檢測到IBV-M基因和IBV-N基因在細胞內(nèi)表達,并具有一定的免疫原性。這為進一步研究IBV的DNA疫苗提供了理論數(shù)據(jù)。3.將構(gòu)建的真核表達載體用脂質(zhì)體PEI25000按照N/P=8進行包裹,制成核酸疫苗,通過腿部肌肉多點注射進行動物免疫試驗,10日齡首免,21日齡加強免疫一次,二免后用IBV H120型毒株進行攻擊,連續(xù)觀察15天后全部撲殺,取腎臟組織進行病毒的檢測,其中H120弱毒疫苗組病毒檢出率為33.3%,M質(zhì)粒組病毒檢出率為50%,N質(zhì)粒組病毒檢出率為40%,單基因的病毒檢出率略高于弱毒苗組,而M+N混合質(zhì)粒組病毒檢出率僅為20%。明顯低于弱毒苗組和單基因組。本研究制備的用PEI25000包裹的DNA疫苗,對IB的防控有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：雞傳染性支氣管炎病毒 M基因 N基因 核酸疫苗 動物保護實驗
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 文獻綜述9-19
• 第一節(jié) 雞傳染性支氣管炎病的研究概況9
• 第二節(jié) 雞傳染性支氣管炎的流行病學(xué)9-10
• 第三節(jié) 雞傳染性支氣管炎病毒的分子生物學(xué)研究10-15
• 1. IBV基因組10-11
• 2. IBV的主要結(jié)構(gòu)蛋白11-15
• 第四節(jié) 雞傳染性支氣管炎疫苗研究進展15-17
• 1. IB弱毒疫苗15
• 2. IB滅活疫苗15-16
• 3. IB基因工程疫苗16-17
• 第五節(jié) DNA疫苗的免疫優(yōu)勢17-19
• 第一章 雞傳染性支氣管炎病毒H120型M,N基因的克隆及序列分析19-34
• 1. 實驗材料19-22
• 1.1 毒株19
• 1.2 質(zhì)粒和宿主菌19
• 1.3 雞胚19-20
• 1.4 數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)軟件20
• 1.5 主要實驗儀器以及實驗耗材20
• 1.6 工具酶及實驗試劑20-21
• 1.7 常用溶液配方21-22
• 2. 實驗方法22-29
• 2.1 雞傳染性支氣管炎病毒的增殖22-23
• 2.2 引物的設(shè)計與合成23
• 2.3 IBV尿囊液總RNA的提取23-24
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄體系與RT-PCR反應(yīng)24-25
• 2.5 PCR產(chǎn)物的清潔回收25-26
• 2.6 目的片段與克隆載體pMD18-T的連接與轉(zhuǎn)化26-27
• 2.7 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選27-28
• 2.8 陽性轉(zhuǎn)化子的雙酶切鑒定28-29
• 3. 實驗結(jié)果29-32
• 3.1 PCR擴增結(jié)果29-30
• 3.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選結(jié)果30-31
• 3.3 pMD18-IBV-M和pMD18-IBV-N的質(zhì)粒雙酶切鑒定31-32
• 4. 討論32-34
• 第二章 雞傳染性支氣管炎病毒M基因和N基因真核載體的構(gòu)建和免疫原性分析34-47
• 1. 實驗材料34-35
• 1.1 質(zhì)粒和宿主菌34
• 1.2 細胞株34-35
• 1.3 常用分子生物學(xué)軟件35
• 1.4 主要實驗儀器及耗材35
• 1.5 工具酶及主要實驗試劑35
• 1.6 常用溶液配方35
• 2. 實驗方法35-42
• 2.1 真核表達載體pEGFP-C1-SCP-SEC質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化35-36
• 2.2 pEGFP-C1-SCP-SEC質(zhì)粒的小量抽提36
• 2.3 pEGFP-C1-SCP-SEC質(zhì)粒和pMD18-IBV-M、pMD18-IBV-N的雙酶切36-37
• 2.4 酶切產(chǎn)物的目的片段膠回收37-38
• 2.5 pEGFP-C1質(zhì)粒與回收產(chǎn)物的連接38
• 2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化38
• 2.7 連接產(chǎn)物陽性轉(zhuǎn)化子的篩選（菌落PCR）38-40
• 2.8 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定40
• 2.9 C1-IBV-M和C1-IBV-N重組質(zhì)粒的間接免疫熒光實驗40-42
• 3. 實驗結(jié)果42-45
• 3.1 菌落PCR篩選42-43
• 3.2 C1-IBV-M和C1-IBV-N重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定43-44
• 3.3 重組質(zhì)粒的間接免疫熒光實驗44-45
• 4. 討論45-47
• 4.1 表達載體的選擇45
• 4.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及間接免疫熒光試驗45-47
• 第三章 雞傳染性支氣管炎病毒M基因和N基因DNA疫苗的制備和免疫原性研究47-53
• 1. 實驗材料47-48
• 1.1 毒株47
• 1.2 質(zhì)粒和宿主菌47
• 1.3 實驗動物47-48
• 1.4 主要實驗儀器及耗材48
• 1.5 實驗試劑48
• 1.6 常用溶液配方48
• 2. 試驗方法48-51
• 2.1 C1-IBV-M和C1-IBV-N質(zhì)粒的大量抽提48-49
• 2.2 質(zhì)粒的純化49-50
• 2.3 質(zhì)粒濃度和純度的測定50
• 2.4 脂質(zhì)體的配置：50
• 2.5 核酸疫苗的配置50
• 2.6 DNA疫苗的免疫原性分析50-51
• 3. 實驗結(jié)果51-52
• 4. 討論52-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻54-70
• 附錄70-71
• 致謝71-72
• 碩士期間發(fā)表論文情況72

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本文編號：580121