本文關(guān)鍵詞：釀酒酵母菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1表達(dá)及其信號通路初步研究

  更多相關(guān)文章： β-防御素-1 瘤胃上皮細(xì)胞 釀酒酵母菌 實(shí)時熒光定量PCR 酶聯(lián)免疫吸附測定 抑制劑 信號通路 綿羊

【摘要】：防御素(Defensins)是生物界中發(fā)現(xiàn)的一類富含半胱氨酸的陽離子內(nèi)源性抗菌肽,具有廣譜的抗微生物活性,在生物體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。本研究選用益生性釀酒酵母菌研究其對體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(Ruminal Epithelial Cells, RECs)p-防御素-1(Sheep-Beta-Defensin-1, SBD-1)表達(dá)的影響及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。首先建立綿羊RECs培養(yǎng)體系作為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?用不同濃度釀酒酵母菌對體外培養(yǎng)的綿羊RECs刺激2 h后分別進(jìn)行不同時間的誘導(dǎo)培養(yǎng),利用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(Realtime fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試驗(yàn)研究接受刺激后RECs SBD-1 mRNA和蛋白表達(dá)的差異,以確定釀酒酵母菌對SBD-1表達(dá)影響的量效和時效關(guān)系。然后選用誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)最高的菌液濃度和誘導(dǎo)培養(yǎng)時間進(jìn)行后續(xù)的信號通路初步研究,采用核因子-kB (Nuclear.factor-kappa B, NF-kB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)的4種特異性抑制劑通過單獨(dú)或組合對各通路中的關(guān)鍵因子進(jìn)行抑制,利用RT-qPCR技術(shù)檢測抑制前后SBD-1 mRNA的表達(dá)量及其信號通路中各因子在釀酒酵母菌刺激前后(TLR-2、MyD88、NF-kB、P38、 JNK、ERK1/2) mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果表明：無論在mRNA還是蛋白水平,釀酒酵母菌均能夠誘導(dǎo)綿羊RECsSBD-1的表達(dá),且菌液濃度為5.2×107CFU·mL-1誘導(dǎo)培養(yǎng)RECs 12 h時,SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高。4種特異性抑制劑無論是單獨(dú)還是組合對各通路進(jìn)行抑制,其抑制效果依次表現(xiàn)為SB202190 PDTC SP600125 PD98059,且信號通路中各因子mRNA在釀酒酵母菌刺激后均有變化。因此,釀酒酵母菌誘導(dǎo)綿羊RECs SBD-1的表達(dá)可能與TLR2-MyD88-NF-kB/MAPKs通路有關(guān),但可能以TLR2-MyD88-MAPKs中的TLR2-MyD88-P38通路為主。
【關(guān)鍵詞】：β-防御素-1 瘤胃上皮細(xì)胞 釀酒酵母菌 實(shí)時熒光定量PCR 酶聯(lián)免疫吸附測定 抑制劑 信號通路 綿羊
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 縮略語表10-11
• 1 引言11-19
• 1.1 抗菌肽11
• 1.2 防御素11-12
• 1.3 β-防御素12-13
• 1.3.1 β-防御素的來源和分布12
• 1.3.2 β-防御素的分子結(jié)構(gòu)特征12-13
• 1.3.3 β-防御素的生物學(xué)活性13
• 1.4 益生性酵母菌13-14
• 1.5 益生菌誘導(dǎo)防御素表達(dá)的研究進(jìn)展14-15
• 1.6 NF-kB及MAPKs信號通路15-16
• 1.7 研究目的及意義16-18
• 1.8 技術(shù)路線18-19
• 2 試驗(yàn)內(nèi)容19-26
• 2.1 材料與方法19
• 2.1.1 試驗(yàn)材料19
• 2.1.2 儀器與試劑19
• 2.2 試驗(yàn)方法19-25
• 2.2.1 綿羊RECs的培養(yǎng)和鑒定19-20
• 2.2.2 釀酒酵母菌的培養(yǎng)20-21
• 2.2.3 釀酒酵母菌誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)及其信號通路初步研究21-22
• 2.2.4 綿羊RECs總RNA的提取22-23
• 2.2.5 總RNA的反轉(zhuǎn)錄23-24
• 2.2.6 RT-qPCR24-25
• 2.2.7 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立25
• 2.2.8 SBD-1 mRNA表達(dá)水平的計(jì)算25
• 2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析25
• 2.3 ELISA檢測共培養(yǎng)上清中SBD-1蛋白的表達(dá)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制25-26
• 3 結(jié)果26-36
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)26
• 3.2 綿羊RECs的鑒定26-27
• 3.3 總RNA純度及質(zhì)量分析27-28
• 3.4 標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定28
• 3.5 RT-qPCR結(jié)果28-30
• 3.5.1 SBD-1基因和β-actin基因RT-qPCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線28-30
• 3.5.2 SBD-1基因和β-actin基因PCR擴(kuò)增效率曲線30
• 3.6 釀酒酵母菌對綿羊RECs SBD-1 mRNA相對表達(dá)量的影響30-31
• 3.7 釀酒酵母菌對綿羊RECs SBD-1 蛋白相對表達(dá)量的影響31-32
• 3.7.1 ELISA試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線31-32
• 3.7.2 釀酒酵母菌誘導(dǎo)RECs培養(yǎng)上清中SBD-1的蛋白表達(dá)檢測結(jié)果32
• 3.8 釀酒酵母菌誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的信號通路初步研究結(jié)果32-36
• 4 討論36-40
• 4.1 釀酒酵母菌誘導(dǎo)綿羊RECs SBD-1的表達(dá)36-37
• 4.2 釀酒酵母菌誘導(dǎo)綿羊RECs SBD-1表達(dá)的信號通路初步研究37-40
• 5 結(jié)論40-41
• 6 展望41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻(xiàn)43-51
• 作者簡介51

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 王傳耀,高美須,蔣夢月;大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及釀酒酵母菌的輻照致死劑量[J];核農(nóng)學(xué)通報;1994年04期

2 夏青;謝田;文紅梅;劉永翔;;8株國外引進(jìn)的釀酒酵母菌的分類鑒定[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年02期

3 牟岱英;劉紅;蔡生力;鐘立強(qiáng);;釀酒酵母菌核糖體RNA沉降系數(shù)的初步研究[J];生物技術(shù)通報;2009年12期

4 岳田利;趙志華;王燕妮;袁亞宏;彭幫柱;高振鵬;;釀酒酵母菌胞內(nèi)海藻糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化[J];農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報;2007年04期

5 張敬慧;;土壤中葡萄酒釀酒酵母菌種的選育[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2011年04期

6 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 蔣耀庭;梁承紅;;靜電輔以激光對釀酒酵母菌的誘變效應(yīng)研究[A];中國物理學(xué)會靜電專業(yè)委員會第十二屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2005年

2 王玉潔;黃玉屏;阮麗芳;劉楠;沈萍;;mel基因在釀酒酵母菌中的克隆和表達(dá)[A];首屆中國青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2002年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 金鑫;釀酒酵母菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1表達(dá)及其信號通路初步研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 徐亞男;非釀酒酵母菌的篩選及產(chǎn)酶研究[D];石河子大學(xué);2016年

3 羅劍輝;降血脂溶栓保健啤酒的初步研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 陳倩;民間酵面及相關(guān)基物中釀酒酵母菌的遺傳多樣性和群體分化研究[D];黑龍江大學(xué);2012年

5 郭珍;釀酒酵母菌重要蛋白質(zhì)HMO2的初步晶體學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

6 李志剛;高產(chǎn)CLA釀酒酵母的篩選、誘變及其亞油酸異構(gòu)酶的分離純化[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

，

本文編號：579176