發(fā)布時間：2017-07-19 14:26

  本文關(guān)鍵詞：miR-425對3T3-L1細胞分化的抑制作用研究

  更多相關(guān)文章： 脂肪細胞分化 miR-425 Zfp423 PPARγ C/EBPα

【摘要】：近年來,大量的研究表明,miRNA在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用,miRNA通過靶定與脂肪細胞分化相關(guān)的基因來調(diào)控脂肪細胞分化。對miRNA進行序列保守性分析、靶基因預測和功能分析,從而選擇miR-425-5p為研究對象。本試驗采用雙熒光素酶報告基因檢測、實時定量PCR(Q-PCR)、免疫印跡(Western blot)等方法對miR-425-5p的作用和功能進行研究。主要的研究結(jié)果如下:(1)經(jīng)miRBase網(wǎng)站對多種物種的miR-425序列對比發(fā)現(xiàn),包括豬在內(nèi)的多種哺乳動物的miR-425-5p的成熟序列保守性很高,只有少許堿基不同,種子序列是完全相同的,保守性也很高。(2)通過實時定量PCR技術(shù)檢測miR-425-5p在5月齡大白豬心、肝、脾等多個組織中的表達量,結(jié)果顯示:miR-425-5p在大白豬中的脂肪組織中的表達量最高,并且在所有脂肪組織中在腹脂中的表達量最高。(3)在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中,miR-425-5p的表達量先下降后上升。轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimics和NC,miR-425-5p inhibitor和inhibitor NC到3T3-L1細胞,誘導細胞分化8天,PPARγ、aP2和C/EBPα表達量明顯下調(diào),油紅O染色也表明miR-425-5p減少脂滴的積累。另外,3T3-L1細胞試驗組中,miR-425-5p明顯降低細胞中甘油三酯的含量。(4)根據(jù)miR-425-5p與靶基因的3’UTR相對應的結(jié)合序列,構(gòu)建了野生型和突變型雙熒光素酶報告載體pmirGLO載體,并將這倆種質(zhì)粒分別于miR-425-5p mimics以及NC共轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞中,檢測熒光活性。結(jié)果顯示,miR-425-5p能識別并結(jié)合Zfp423的3’UTR對應序列。(5)在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中,Zfp423的表達量先上升后下降的。轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimics和NC,miR-425-5p inhibitor和inhibitor NC到3T3-L1細胞并誘導分化6天。實時定量結(jié)果顯示miR-425-5p在轉(zhuǎn)染mimics后表達量明顯比NC組高,在轉(zhuǎn)染Inhibitor后表達量明顯比Inhibitor NC組低,但是在Zfp423的mRNA水平上實驗組和對照組沒有明顯差異。Western blot結(jié)果顯示miR-425-5p調(diào)控Zfp423轉(zhuǎn)錄后水平。以上結(jié)果表明,miR-425-5p抑制Zfp423的翻譯水平,從而抑制脂肪細胞分化過程。
【關(guān)鍵詞】：脂肪細胞分化 miR-425 Zfp423 PPARγ C/EBPα
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 中英文縮寫對照表12-13
• 第一章 文獻綜述13-24
• 1 引言13
• 2 脂肪概述13-17
• 2.1 脂肪組織的分類13-14
• 2.1.1 白色脂肪組織13-14
• 2.1.2 棕色脂肪組織14
• 2.2 脂肪組織的生成14-15
• 2.3 脂肪細胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控15-17
• 2.3.1 PPARγ15-16
• 2.3.2 C/EBPα16-17
• 3 microRNA及其對脂肪細胞分化的調(diào)控17-21
• 3.1 microRNA的生物合成和作用機制17-18
• 3.2 miRNA對脂肪細胞分化的調(diào)控18-21
• 3.2.1 miRNA促進脂肪細胞分化19-20
• 3.2.2 miRNA抑制脂肪細胞分化20-21
• 4 miR-425 可能是調(diào)控脂肪細胞分化的重要候選miRNA21-23
• 4.1 Zfp423基因與脂肪生成的相關(guān)研究21-23
• 4.2 miR-425 的研究23
• 5 研究目的和意義23-24
• 第二章 材料與方法24-42
• 2.1 載體和菌株24
• 2.2 主要試劑和儀器24-25
• 2.3 主要溶液的配制25-26
• 2.4 細胞培養(yǎng)及誘導分化26-27
• 2.4.1 細胞的復蘇26
• 2.4.2 細胞的常規(guī)培養(yǎng)26
• 2.4.3 細胞凍存26-27
• 2.4.4 3T3-L1細胞的誘導分化27
• 2.5 細胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性的測定27-28
• 2.5.1 細胞的轉(zhuǎn)染27
• 2.5.2 雙熒光素酶相對活性的檢測27-28
• 2.5.2.1 細胞裂解27-28
• 2.6 細胞總RNA的提取28-29
• 2.7 Q-PCR分析29-32
• 2.7.1 miRNA的定量分析29-30
• 2.7.2 基因的定量分析30-32
• 2.8 油紅O染色32
• 2.9 甘油三酯和游離脂肪酸含量的測定32-33
• 2.10 靶基因預測以及預測靶基因 3’UTR雙熒光素酶報告載體及其突變載體的構(gòu)建33-39
• 2.10.1 靶基因預測33
• 2.10.2 預測靶基因 3’UTR雙熒光素酶報告載體及其突變載體的構(gòu)建33-39
• 2.11 靶基因的鑒定39
• 2.12 Western blotting分析39-41
• 2.12.1 蛋白提取39
• 2.12.2 SDS-PAGE電泳39-40
• 2.12.3 轉(zhuǎn)膜40
• 2.12.4 抗原抗體免疫反應40-41
• 2.12.5 抗體41
• 2.13 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件41
• 2.14 統(tǒng)計學分析41-42
• 第三章 結(jié)果與分析42-51
• 3.1 miR4255p序列保守性分析42
• 3.2 miR4255p的組織表達譜分析42-43
• 3.3 miR4255p的細胞表達譜分析43-44
• 3.4 miR4255p抑制小鼠 3T3-L1前脂肪細胞的分化44-47
• 3.5 miR4255p靶基因的鑒定47-49
• 3.6 miR4255p通過靶定Zfp423抑制脂肪細胞分化49-51
• 第四章 討論51-54
• 4.1 miR4255p的靶基因預測51-52
• 4.2 miR4255p通過調(diào)控Zfp423的表達來抑制脂肪細胞分化52-53
• 4.3 miR4255p抑制脂肪細胞分化的意義53-54
• 第五章 結(jié)論54-55
• 5.1 本研究的主要成果54
• 5.2 本實驗不足之處及下一步計劃54-55
• 參考文獻55-63
• 附錄63-64
• 致謝64

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