本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型微滴式數(shù)字PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 檢測 微滴式數(shù)字PCR 豬圓環(huán)病毒2型 TaqMan熒光定量PCR

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,1991年首次發(fā)現(xiàn)于加拿大。PMWS臨床特征主要有斷奶仔豬呼吸困難、腹瀉、黃疸、明顯的淋巴組織病變和進(jìn)行性消瘦。豬場中PCV2感染率高,建立靈敏而快速的分子診斷方法有助于對(duì)該疾病進(jìn)行早期診斷,有助于控制PCV2的傳播,有助于種豬進(jìn)出口時(shí)快速靈敏地進(jìn)行病原體的檢驗(yàn)檢疫。本研究建立了一種新型的、靈敏的并且操作簡單的PCV2微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)定量檢測方法,將其應(yīng)用于檢測種豬血清樣品、豬內(nèi)臟組織、PCV2疫苗半成品中PCV2病毒含量的情況,并與TaqMan熒光定量PCR (TaqMan flurogenic quantitative PCR, qPCR)方法進(jìn)行比較驗(yàn)證,獲得滿足出入境檢驗(yàn)檢疫需求的豬圓環(huán)病毒高效靈敏的檢疫方法。本研究主要內(nèi)容及結(jié)果如下：1.PCV2ddPCR檢測方法的建立根據(jù)PCV2中國株(ZJG1103)的基因全長,設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,并成功擴(kuò)增出全基因組,通過連接與轉(zhuǎn)化后,將全基因構(gòu)建到pMD19-T載體上,成功制備了PCV2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PCV2。根據(jù)GenBank中登錄的PCV2 ORF2基因序列(KC823059.1),設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物及探針,在進(jìn)行引物探針濃度和PCR退火溫度的優(yōu)化后,分別建立了PCV2的qPCR和ddPCR檢測方法。兩種方法的線性關(guān)系試驗(yàn)表明,在9.85×105-12.5拷貝／μL的檢測范圍內(nèi),ddPC R與qPCR均具有良好的線性關(guān)系(R2=～1),當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品被稀釋到108倍以下時(shí),qPCR已無明顯的擴(kuò)增曲線,而ddPCR乃可檢測到具有熒光信號(hào)的陽性微滴,其最低檢測極限約25拷貝/μL,敏感性比qPCR高4倍,ddPCR表現(xiàn)出更寬的動(dòng)態(tài)檢測范圍。利用建立的PCV2ddPCR方法檢測PCV1、PRV、PPV、PRRSV和CSFV的核酸,結(jié)果均呈陰性,表明該方法特異性強(qiáng),檢測結(jié)果可靠。重復(fù)性試驗(yàn)中,組內(nèi)試驗(yàn)和組問試驗(yàn)變異系數(shù)(CV%)均小于3%,表明建立的ddPCR檢測方法重復(fù)性好且穩(wěn)定性高,可用于后期檢測臨床樣品。2. PCV2 ddPCR檢測方法的初步應(yīng)用用本研究建立的ddPCR檢測107份來自疑似發(fā)病豬場的種豬血清樣品,ddPCR和qPCR的核酸陽性檢出率分別為84.1%和80.4%。Kappa分析比較兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Kappa系數(shù)為0.89(SE=0.06,95%置信區(qū)間),表明兩種檢測方法之間有良好的符合率。另外,用建立的PCV2 ddPCR和qPCR方法檢測豬內(nèi)臟組織樣品,核酸陽性檢出率分別為41.7%和29.2%,ddPCR表現(xiàn)出更高的靈敏度。最后,用ddPCR和qPCR方法分別檢測PCV2疫苗半成品中的病毒含量,ddPCR定量檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的TCID50方法測定的結(jié)果更一致。因此,本研究建立的ddPCR檢測方法可以用于多種臨床樣品PCV2的定量檢測。
【關(guān)鍵詞】：檢測 微滴式數(shù)字PCR 豬圓環(huán)病毒2型 TaqMan熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略詞表9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-26
• 1 PCV的病原學(xué)特征14-16
• 1.1 PCV的發(fā)現(xiàn)14-15
• 1.2 PCV形態(tài)及理化特性15
• 1.3 培養(yǎng)特性15
• 1.4 PCV基因組結(jié)構(gòu)特征15-16
• 1.5 PCV的復(fù)制16
• 2 PCV2的致病機(jī)制16-17
• 3 PCV2的流行及相關(guān)疾病17-19
• 3.1 PCV2的流行情況17
• 3.2 PCV2的相關(guān)疾病17-19
• 3.2.1 斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)17-18
• 3.2.2 豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)18
• 3.2.3 增生和壞死性肺炎(PNP)18
• 3.2.4 繁殖障礙病(Reproductive failure)18
• 3.2.5 仔豬先天性震顫(CT)18-19
• 4 PCV2的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)研究進(jìn)展19-23
• 4.1 PCV2免疫學(xué)診斷方法19-20
• 4.1.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)19
• 4.1.2 間接免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence assay,IFA)19
• 4.1.3 過氧化物酶單層試驗(yàn)(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)19-20
• 4.1.4 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)20
• 4.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)20-23
• 4.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)20-22
• 4.2.2 限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)22
• 4.2.3 核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)22-23
• 4.2.4 原位雜交技術(shù)(Nucleic acid probe and in situ hybridization,ISH)23
• 4.2.5 基因芯片技術(shù)23
• 5 微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR,ddPCR)23-25
• 5.1 技術(shù)原理及優(yōu)勢24
• 5.2 研究進(jìn)展24-25
• 6 研究目的與意義25-26
• 第二章 豬圓環(huán)病毒2型微滴式數(shù)字PCR檢測方法的建立26-43
• 1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器26-27
• 1.2 主要試劑27
• 1.3 實(shí)驗(yàn)樣品27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-33
• 2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成27-28
• 2.2 病毒核酸的提取28
• 2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄28-29
• 2.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備29-30
• 2.4.1 目的片段的擴(kuò)增29
• 2.4.2 目的片段的回收與純化29
• 2.4.3 純化產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化29
• 2.4.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備29-30
• 2.5 qPCR檢測條件的確定30
• 2.6 ddPCR檢測方法的建立30-33
• 2.6.1 ddPCR的工作流程30-31
• 2.6.2 ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化31-32
• 2.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及對(duì)比32
• 2.6.4 特異性試驗(yàn)32
• 2.6.5 敏感性試驗(yàn)32
• 2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn)32-33
• 3 結(jié)果33-41
• 3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備33
• 3.2 qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化33-35
• 3.2.1 退火溫度優(yōu)化33-34
• 3.2.2 引物濃度優(yōu)化34
• 3.2.3 探針濃度優(yōu)化34-35
• 3.3 ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化35-37
• 3.3.1 退火溫度優(yōu)化35-36
• 3.3.2 引物濃度的優(yōu)化36
• 3.3.3 探針濃度的優(yōu)化36-37
• 3.4 ddPCR與qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及對(duì)比37-38
• 3.5 特異性試驗(yàn)38-39
• 3.6 敏感性試驗(yàn)39-40
• 3.7 重復(fù)性試驗(yàn)40-41
• 4 分析與討論41-42
• 5 小結(jié)42-43
• 第三章 豬圓環(huán)病毒2型微滴式數(shù)字PCR檢測方法的初步應(yīng)用43-51
• 1 材料和方法43-46
• 1.1 臨床樣品采集43
• 1.2 主要試劑及耗材43-44
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器44
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 1.4.1 組織樣品處理44
• 1.4.2 病毒DNA提取44-45
• 1.4.3 ddPCR檢測方法臨床應(yīng)用45-46
• 2 結(jié)果46-48
• 2.1 臨床血清樣品檢測46-47
• 2.2 不同臟器組織中PCV2含量檢測47
• 2.3 PCV2疫苗半成品病毒含量檢測47-48
• 3 分析與討論48-50
• 4 小結(jié)50-51
• 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)51-52
• 1 結(jié)論51
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄60

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：559608