發(fā)布時(shí)間：2017-07-18 20:12

  本文關(guān)鍵詞：豬源抗菌肽Cecropin P1的原核表達(dá)及抑菌活性檢測

  更多相關(guān)文章： 抗菌肽 Cecropin Pl 原核表達(dá) 腸激酶 抗菌活性

【摘要】：隨著抗生素的使用,藥物殘留和菌株耐藥性等問題日益嚴(yán)重,尋找抗生素替代品己迫在眉睫。抗菌肽以其獨(dú)特的抗菌機(jī)制及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),在替代傳統(tǒng)抗生素、減少菌株耐藥性等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。天蠶素(Cecropins)是首先由Huhmark等人在惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽,目前已有30多種天蠶素被報(bào)道,其中Cecropin P1 (CP1)是Lee等首先從豬小腸分離得到的抗菌肽,由31個(gè)氨基酸組成,分子量為3339 Da,具有廣譜抗菌活性。但由于CP1的天然產(chǎn)量有限,分離純化困難且成本較高,極大限制了它的臨床應(yīng)用,因此通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)CP1具有重要的意義。為探索大量獲取CP1的基因工程方法。本研究根據(jù)CP1成熟肽的氨基酸序列,利用大腸桿菌密碼子偏愛性特點(diǎn),采用搭橋PCR技術(shù),設(shè)計(jì)合成CP1目的基因,并構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-CP1.利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI分別對(duì)原核表達(dá)載體pCold TF和重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-CP1雙酶切,并在T4 DNA連接酶的作用下構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-CP1。將pCold TF-CP1轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,所得陽性轉(zhuǎn)化菌株(重組質(zhì)粒工程菌)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白(rCP1)。rCP1經(jīng)Ni-NTA柱純化及超濾除鹽濃縮后,由腸激酶切割釋放CP1。最后采用薄層平皿瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法對(duì)CP1抑菌活性進(jìn)行檢測。主要研究結(jié)果如下：(1)通過搭橋PCR技術(shù)成功合成CP1目的基因,并構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-CP1。(2)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-CP1,并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞得到重組質(zhì)粒工程菌。(3)重組質(zhì)粒工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性融合蛋白,其占總可溶性蛋白的36%以上；融合蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化后純度約為80%；通過超微量分光光度計(jì)(NANODROP 2000)測定超濾后的濃縮蛋白濃度為3.5 mg/mL：經(jīng)計(jì)算每升菌體培養(yǎng)物可獲得約55 mg融合蛋白。(4)通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較,確定2.8 mg/mL rCP1經(jīng)腸激酶切割釋放出(0.144±0.04)mg/mL CP1�？咕囼�(yàn)結(jié)果表明,CP1對(duì)肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和沙門氏菌有良好的抗菌活性。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功獲得了rCP1, rCP1經(jīng)腸激酶切割后釋放出具有良好抗肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和沙門氏菌活性的CP1,為建立基因工程菌規(guī)�；a(chǎn)抗菌肽相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)和提供了科學(xué)參考。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 Cecropin Pl 原核表達(dá) 腸激酶 抗菌活性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S859.797;Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 縮略詞表8-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1 抗菌肽的研究進(jìn)展13-21
• 1.1 抗菌肽的概述13-21
• 1.1.1 抗菌肽的分類14
• 1.1.2 抗菌肽的理化性質(zhì)14-16
• 1.1.3 抗菌肽的作用機(jī)理16-18
• 1.1.4 抗菌肽的基因工程研究18-19
• 1.1.5 抗菌肽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用19-20
• 1.1.6 面臨的問題20-21
• 2 豬源抗菌肽Cecropin P121-23
• 2.1 Cecropin P1的結(jié)構(gòu)21
• 2.2 Cecropin P1的抗菌機(jī)理21-23
• 第二部分 試驗(yàn)研究23-71
• 第一章 抗菌肽Cecropin P1目的基因的人工合成23-34
• 1 試驗(yàn)材料23-25
• 1.1 菌株和載體23
• 1.2 主要試劑23-24
• 1.3 溶液配置24
• 1.4 主要儀器24-25
• 2 試驗(yàn)方法25-31
• 2.1 CP1目的基因設(shè)計(jì)25-26
• 2.2 引物設(shè)計(jì)26
• 2.3 CP1目的基因的人工合成26-27
• 2.3.1 初級(jí)延伸反應(yīng)26
• 2.3.2 次級(jí)延伸反應(yīng)26-27
• 2.4 目的基因的克隆及鑒定27-31
• 2.4.1 CP1目的基因的回收27
• 2.4.2 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備27-28
• 2.4.3 CP1目的基因與載體質(zhì)粒的連接28-29
• 2.4.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌DH5α29
• 2.4.5 重組質(zhì)粒的鑒定29-31
• 3 試驗(yàn)結(jié)果31-32
• 3.1 CP1目的基因的人工合成31
• 3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定31-32
• 3.3 測序鑒定32
• 4 討論32-34
• 第二章 重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-CP1的構(gòu)建34-44
• 1 試驗(yàn)材料34-36
• 1.1 菌株和載體34
• 1.2 主要試劑34-35
• 1.3 溶液配制35
• 1.4 主要儀器35-36
• 2 試驗(yàn)方法36-41
• 2.1 CP1目的基因的制備36-37
• 2.2 原核表達(dá)載體pCold TF基因片段的制備37
• 2.3 CP1目的基因與表達(dá)載體的連接37-38
• 2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α38
• 2.5 重組質(zhì)粒的鑒定38-41
• 2.5.1 重組質(zhì)粒抽提38-39
• 2.5.2 菌落PCR鑒定39-40
• 2.5.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定40-41
• 2.5.4 重組質(zhì)粒的測序鑒定41
• 3 試驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.1 菌落PCR鑒定41-42
• 3.2 酶切鑒定結(jié)果42
• 3.3 測序鑒定結(jié)果42
• 4 討論42-44
• 第三章 重組質(zhì)粒工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)44-57
• 1 試驗(yàn)材料44-47
• 1.1 菌株和質(zhì)粒44
• 1.2 主要試劑44-45
• 1.3 溶液配制45-46
• 1.4 主要儀器46-47
• 2 試驗(yàn)方法47-51
• 2.1 重組質(zhì)粒工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)47-48
• 2.1.1 重組質(zhì)粒工程菌的制備47
• 2.2.2 重組表達(dá)工程菌的初步表達(dá)47-48
• 2.2.3 SDS-PAGE電泳檢測48
• 2.2 重組表達(dá)蛋白的可溶性檢測48-49
• 2.3 誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間選擇49
• 2.4 誘導(dǎo)劑的濃度選擇49
• 2.5 重組表達(dá)蛋白的免疫印跡分析(Western-blot)49-51
• 2.5.1 蛋白質(zhì)樣品制備49
• 2.5.2 SDS-PAGE電泳49-50
• 2.5.3 Western-blot雜交檢測50-51
• 3 試驗(yàn)結(jié)果51-55
• 3.1 重組質(zhì)粒工程菌的初步表達(dá)51-52
• 3.2 重組表達(dá)蛋白的可溶性鑒定52
• 3.3 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化52-53
• 3.4 IPTG工作濃度優(yōu)化53-54
• 3.5 重組表達(dá)蛋白免疫印跡分析54-55
• 4 討論55-57
• 第四章 抗菌肽CP1的釋放及抑菌活性檢測57-71
• 1 試驗(yàn)材料57-59
• 1.1 菌株57
• 1.2 主要試劑57-58
• 1.3 溶液配制58
• 1.4 主要儀器58-59
• 2 試驗(yàn)方法59-61
• 2.1 融合蛋白的處理59-60
• 2.1.1 融合蛋白純化59-60
• 2.1.2 融合蛋白除鹽濃縮60
• 2.2 融合蛋白rCP1的切割60-61
• 2.3 Tricine-SDS-PAGE61
• 2.4 酶切產(chǎn)物的活性檢測61
• 2.5 酶切產(chǎn)物的分析61
• 3 試驗(yàn)結(jié)果61-69
• 3.1 融合蛋白rCP1的純化61-62
• 3.2 融合蛋白的濃縮62-63
• 3.3 融合蛋白的切割63-64
• 3.4 酶切產(chǎn)物的活性檢測64-66
• 3.5 酶切產(chǎn)物的分析66-69
• 4 討論69-71
• 總結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-79
• 致謝79-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文80

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：559570