本文關(guān)鍵詞：二甲氧芐啶在豬、雞和魚體內(nèi)的殘留消除研究

  更多相關(guān)文章： 二甲氧芐啶 主要代謝物 殘留消除 高效液相色譜 最高殘留限量 休藥期

【摘要】：二甲氧芐啶是一種動(dòng)物專用的抗菌增效劑,與磺胺藥聯(lián)用能從雙重機(jī)制阻斷敏感菌體內(nèi)的葉酸合成、抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,從而發(fā)揮優(yōu)良的抗菌效應(yīng)。其用途主要在于預(yù)防和治療雞的球蟲病與動(dòng)物腸道的感染,自身也可以起到殺滅球蟲的效果。但是二甲氧芐啶的毒理學(xué)試驗(yàn)證明其具有遺傳毒性,所以動(dòng)物用藥后在體內(nèi)的殘留與人類的健康息息相關(guān)。藥物的殘留檢測(cè)是對(duì)可食性動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一,而二甲氧芐啶在畜禽體內(nèi)殘留消除的相關(guān)報(bào)道比較少。為了完善對(duì)二甲氧芐啶的安全評(píng)價(jià),確定其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留靶組織、殘留標(biāo)示物、最高殘留限量和休藥期等,本課題在放射性示蹤研究的基礎(chǔ)上,開展了二甲氧芐啶與其主要代謝物在豬、雞和魚體內(nèi)的殘留消除試驗(yàn),研究結(jié)果將會(huì)為二甲氧芐啶的殘留檢控提供一個(gè)科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。1二甲氧芐啶主要代謝物對(duì)照品的制備以香蘭素為原料,氯甲基甲醚為羥基保護(hù)試劑,兩者的摩爾比為1:1.1,制得淺黃色4-甲氧甲氧基香蘭素(產(chǎn)率85%)。以此化合物和丙烯腈為原料,控制摩爾比為1:1.2,在40℃反應(yīng)4小時(shí),加入硝酸胍,反應(yīng)得到4-甲氧甲氧基二甲氧芐啶(產(chǎn)率75%)。以此為原料,向溶液中緩慢滴加37%鹽酸,反應(yīng)得到4-脫甲基二甲氧芐啶(DVD1,產(chǎn)率60%)。對(duì)其進(jìn)行各項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,結(jié)構(gòu)正確,純度大于97%,穩(wěn)定性良好,滿足對(duì)照品的要求。2二甲氧芐啶及其主要代謝物殘留檢測(cè)方法的建立根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期放射性示蹤研究的結(jié)果,確定二甲氧芐啶的主要代謝物為DVD1(4-脫甲基二甲氧芐啶),DVD2(4-脫甲基二甲氧芐啶葡萄糖醛酸結(jié)合物)。本試驗(yàn)建立了DVD及DVD1在豬和雞的肝臟、腎臟、肌肉、脂肪(皮脂)、心、肺、胃、ii大腸和小腸9種組織;魚的肝臟、腎臟、肌肉、皮膚及胃腸道5種組織中的高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取,MCX小柱凈化,0.01%氨水和甲醇(71:29,V/V)混合試劑復(fù)溶,通過HPLC進(jìn)行檢測(cè)。樣品若需水解,則先加入3 m L 0.2 mol/L的醋酸銨緩沖液,40μL的β-葡萄糖醛酸酶37℃孵育12 h,冷卻到室溫后再進(jìn)行提取。具體的液相條件如下,色譜柱:ZORBAX Extend C18(4.6×250 mm,5μm);流動(dòng)相:A:0.01%氨水,B:甲醇(71:29,V/V);紫外檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;進(jìn)樣量:30μL;柱溫:30℃。該方法下DVD和DVD1在豬、雞和鯉各組織的LOQ為40μg/kg。動(dòng)物各商品及非商品組織中添加3個(gè)不同定量限水平的藥物,回收率均在70%以上,且日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在14%以下。本課題建立的殘留檢測(cè)方法可以滿足定量分析要求,能用于二甲氧芐啶及其代謝產(chǎn)物的殘留檢測(cè)分析。3二甲氧芐啶在豬、雞和魚體內(nèi)的殘留消除研究按照獸藥典推薦劑量和方法口服二甲氧芐啶,研究二甲氧芐啶及其代謝物在3種食品動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,進(jìn)一步確證二甲氧芐啶在豬、雞和鯉體內(nèi)的殘留標(biāo)識(shí)物與靶組織。24頭健康的三元雜交豬,36羽20日齡科寶肉雞和30尾健康鯉魚,按照二甲氧芐啶10 mg/kg b.w.連續(xù)灌胃7 d。停藥后在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺動(dòng)物,取豬和雞的9種組織,魚的5種組織。按照上述方法測(cè)定二甲氧芐啶及其主要代謝物的殘留量,結(jié)果如下:豬:停藥6 h,各組織均檢測(cè)到DVD1和DVD,藥物濃度范圍分別為63.2-519.9μg/kg,357.5-2297.0μg/kg,腎臟濃度最高。1 d后肌肉、心臟、肺臟和小腸中已檢測(cè)不到DVD1,DVD濃度也大幅降低。停藥3 d,大部分組織中DVD1濃度低于LOQ,僅肝臟、腎臟、脂肪中能檢測(cè)出DVD1,濃度分別為77.6μg/kg,190.1μg/kg,51.9μg/kg;停藥5 d,所有組織中DVD1的濃度均降至定量限以下,在脂肪、心臟、胃、大腸、小腸中DVD濃度也消除至定量限附近。停藥7 d,肝臟和腎臟DVD的濃度分別是96.5μg/kg和115.1μg/kg,其余各組織中的藥物含量均低于定量限。14 d,所有組織均已檢測(cè)不到藥物存在。用葡萄糖醛酸酶處理豬的各組織后,發(fā)現(xiàn)6 h和1 d在豬的肝臟和腎臟中DVD1的濃度有所增加,6 h的濃度分別為319.4μg/kg和942.8μg/kg,腎臟中DVD1的含量變化較大,說明6 h腎臟中DVD2的濃度比較高;1 d時(shí)肝臟、腎臟中DVD1的濃度為199.3μg/kg和680.5μg/kg;3 d后DVD1的濃度已無明顯變化,可見其消除速度較快。結(jié)果表明,二甲氧芐啶在豬體內(nèi)的殘留量低,殘留物消除迅速,DVD原形為殘留標(biāo)示物,腎臟為殘留靶組織。雞:停藥6 h,除心臟和小腸外所有組織中均能檢測(cè)到DVD1和DVD,濃度范圍分別是53.6-738.5μg/kg、3356.4μg/kg-8541.4μg/kg;停藥1 d,僅腎臟中能檢測(cè)到DVD1,濃度為45.8μg/kg,DVD消除也比較快,各組織中濃度下降至327.5-1764.6μg/kg;停藥3 d,DVD1在所有組織中消除至LOQ之下;停藥7 d,DVD在肝臟中的濃度是107.4μg/kg,在腎臟中的濃度是118.7μg/kg,其他組織中DVD的濃度均在100.0μg/kg以內(nèi);停藥9 d,肝臟中DVD的濃度為68.1μg/kg,腎臟中濃度為77.8μg/kg,其他組織已檢測(cè)不到任何藥物。用葡萄糖醛酸酶處理各組織后只在6 h的肝臟和腎臟檢測(cè)到DVD1的含量有所增加,分別是987.2μg/kg和612.3μg/kg,1d后DVD1的含量已無明顯變化,表明DVD2消除速度非�？�,殘留時(shí)間很短。綜上發(fā)現(xiàn)DVD1、DVD2在雞各組織中消除迅速,殘留時(shí)間最長(zhǎng)的化合物為DVD。結(jié)果證明,二甲氧芐啶在雞的殘留靶組織是腎臟,殘留標(biāo)示物是原型。魚:停藥6 h,肝臟、腎臟、肌肉、皮膚和胃腸道僅能檢測(cè)到原型DVD,酶解后也未檢測(cè)到DVD1,說明魚組織中沒有DVD1和DVD2的殘留或殘留量低于檢測(cè)限。但是各組織中DVD的濃度都比較高,濃度范圍在6632.9-8671.0μg/kg,腎臟最高;停藥1d后,各組織中DVD濃度在2539.6-5265.6μg/kg;停藥7 d,各組織中的DVD濃度消除至401.6μg/kg之下;停藥14 d,肝臟中DVD濃度為77.6μg/kg,腎臟中為99.7μg/kg,其余組織中DVD濃度已消除至LOQ以下。可見二甲氧芐啶在魚各組織中濃度較高,但消除迅速,殘留標(biāo)示物為DVD,殘留靶組織為腎臟。4豬和雞可食性組織中二甲氧芐啶最高殘留限量和休藥期的制訂本研究,按照美國(guó)FDA和歐盟EMEA獸藥食品安全性評(píng)價(jià)的原則和方法,制定二甲氧芐啶的MRLs和WDT。按照FDA的原則,二甲氧芐啶在豬和雞體內(nèi)的休藥期均為1 d。在豬肝、腎、肌肉和脂肪中的MRL分別為791、1067、334和1938μg/kg;在雞肝、腎、肌肉和脂肪中的MRL分別為972、1951、367和2138μg/kg;按照EMEA的原則,二甲氧芐啶在豬和雞體內(nèi)的休藥期分別為10和12 d,在豬和雞的肝、腎、肌肉和脂肪(皮脂)的MRL均為100μg/kg。綜合分析兩個(gè)程序評(píng)價(jià)結(jié)果,建議采用相對(duì)保守的EMEA的評(píng)價(jià)程序所制定的休藥期和殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述,本課題首次制備出1種二甲氧芐啶主要代謝物的對(duì)照品,并建立二甲氧芐啶及其主要代謝產(chǎn)物在豬、雞和鯉商品和非商品組織中的殘留檢測(cè)方法,同時(shí)對(duì)二甲氧芐啶在豬、雞和鯉魚體內(nèi)的殘留消除規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,對(duì)殘留標(biāo)示物和殘留靶組織進(jìn)行了進(jìn)一步的確證,制定出了在豬和雞體內(nèi)的最高殘留限量和休藥期,其研究結(jié)果為臨床合理用藥、藥物安全性評(píng)價(jià)等提供了科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：二甲氧芐啶 主要代謝物 殘留消除 高效液相色譜 最高殘留限量 休藥期
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S859.84;S948
【目錄】：

• 摘要8-12
• Abstract12-16
• 縮略語表16-19
• 1 前言19-26
• 1.1 立題依據(jù)19-22
• 1.2 二甲氧芐啶的研究進(jìn)展22-26
• 1.2.1 二甲氧芐啶的代謝研究22-24
• 1.2.2 二甲氧芐啶的殘留消除研究24-26
• 1.3 研究?jī)?nèi)容與目標(biāo)26
• 2 材料與方法26-34
• 2.1 藥品和試劑26-27
• 2.2 主要儀器和設(shè)備27-29
• 2.3 二甲氧芐啶主要代謝物對(duì)照品的制備29-30
• 2.3.1 DVD1的合成方法29
• 2.3.2 DVD1的結(jié)構(gòu)表征鑒定、純度及理化性質(zhì)研究29-30
• 2.4 二甲氧芐啶及其主要謝物在動(dòng)物可食性組織中殘留檢測(cè)方法的建立30-33
• 2.4.1 溶液的配制30-31
• 2.4.2 HPLC色譜條件31
• 2.4.3 樣品處理方法31-32
• 2.4.4 特異性32
• 2.4.5 最低檢測(cè)限與最低定量限32
• 2.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線32
• 2.4.7 準(zhǔn)確度與精密度32-33
• 2.4.8 穩(wěn)定性考核33
• 2.5 二甲氧芐啶在豬、雞和魚體內(nèi)的殘留消除研究33-34
• 2.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 2.5.2 給藥與樣品采集33-34
• 2.5.3 樣品定量及數(shù)據(jù)處理34
• 3 結(jié)果與分析34-70
• 3.1 二甲氧芐啶主要代謝物對(duì)照品制備的結(jié)果34-38
• 3.1.1 DVD1的結(jié)構(gòu)鑒定34-37
• 3.1.2 DVD1的純度、熔點(diǎn)、吸光系數(shù)和穩(wěn)定性結(jié)果37-38
• 3.2 二甲氧芐啶及其主要代謝物在動(dòng)物可食性組織中的定量方法學(xué)結(jié)果38-48
• 3.2.1 特異性38
• 3.2.2 最低檢測(cè)限與最低定量限38
• 3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立38-39
• 3.2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差39-48
• 3.2.5 穩(wěn)定性結(jié)果48
• 3.3 二甲氧芐啶及其主要代謝物在3種動(dòng)物組織中的殘留消除規(guī)律48-70
• 3.3.1 二甲氧芐啶及其主要代謝物在豬組織中的殘留消除規(guī)律48-56
• 3.3.2 二甲氧芐啶及其主要代謝物在雞組織中的殘留消除規(guī)律56-64
• 3.3.3 二甲氧芐啶及其主要代謝物在魚組織中的殘留消除規(guī)律64-70
• 4 二甲氧芐啶在食品動(dòng)物的安全性評(píng)價(jià)70-77
• 4.1 FDA71-73
• 4.1.1 每日允許攝入量(ADI)71
• 4.1.2 安全濃度（Safety Concentration, SC）71-72
• 4.1.3 殘留靶組織與殘留標(biāo)示物72
• 4.1.4 最高殘留限量（MRLs）72-73
• 4.1.5 休藥期73
• 4.2 EMEA73-77
• 4.2.1 每日允許攝入量(ADI)73
• 4.2.2 安全濃度（Safety Concentration, SC）73-74
• 4.2.3 殘留靶組織與殘留標(biāo)示物74
• 4.2.4 最高殘留限量(MRLs)74
• 4.2.5 計(jì)算TMDI74-75
• 4.2.6 休藥期75-77
• 5 討論77-82
• 5.1 二甲氧芐啶主要代謝物對(duì)照品的制備77
• 5.2 二甲氧芐啶及其主要代謝物的定量方法學(xué)討論77-79
• 5.3 二甲氧芐啶在食品動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除規(guī)律79-82
• 6 全文總結(jié)82-83
• 7 文獻(xiàn)綜述83-98
• 7.1 作用機(jī)制83-84
• 7.2 應(yīng)用于臨床的抗菌增效劑84-97
• 7.2.1 甲氧芐啶84-87
• 7.2.2 二甲氧芐啶87-92
• 7.2.3 巴喹普林92-95
• 7.2.4 溴莫普林95-97
• 7.3 存在的問題及其原因、解決辦法和可行性分析97-98
• 參考文獻(xiàn)98-105
• 致謝105-106
• 附錄Ⅰ---作者簡(jiǎn)介106-107
• 附錄Ⅱ---定量方法學(xué)原始數(shù)據(jù)107-119
• 附錄Ⅲ---3種動(dòng)物各個(gè)體的藥物濃度119-126
• 對(duì)各答辯委員的答復(fù)書126-127

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