本文關(guān)鍵詞：小反芻獸疫病毒N75-1株在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的增殖規(guī)律研究

  更多相關(guān)文章： 小反芻獸疫病毒 山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞 熒光定量PCR 增殖規(guī)律 Western blot法

【摘要】：小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種感染山羊、綿羊的急性高度傳染性疾病。PPR是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定報告動物疾病,我國將此病列為一類動物疾病。近年來,PPR疫情在包括我國在內(nèi)的世界多個國家已發(fā)生或正在發(fā)生,對疫情國公共衛(wèi)生及養(yǎng)羊行業(yè)造成了重大威脅。加強對PPRV的檢測分析及其增殖規(guī)律研究對于PPR防控具有重要意義。本研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的PPRV-N基因序列,設(shè)計合成了一對擴增N基因的特異性引物,通過基因擴增,載體構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的梯度稀釋,建立了用于檢測PPRV實時熒光定量PCR方法。利用建立的熒光定量PCR方法以及Western blot法對PPRV N75-1疫苗株在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(EEC)內(nèi)的增殖規(guī)律進(jìn)行了檢測分析,獲得的結(jié)果如下:1.成功建立了用于檢測PPRV的實時熒光定量PCR方法,結(jié)果表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.973,擴增效率為126.0%。該法特異性強、敏感度高、重復(fù)性好,可用于對PPRV的定量檢測。2.PPRV能夠引起EEC細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變,接種PPRV 48h后EEC細(xì)胞開始出現(xiàn)早期輕微細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),至72h后細(xì)胞CPE較為明顯,96h細(xì)胞開始出現(xiàn)裂解現(xiàn)象。接種MOI=10的PPRV N75-1株,分別在0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、72h收取細(xì)胞,通過建立的qPCR方法檢測病毒增殖水平,發(fā)現(xiàn)接種后3h時N基因轉(zhuǎn)錄水平有一定的升高,6h時有明顯的升高,在接種后9h達(dá)到了最高的水平,從接種后12h開始下降,然后形成了一個穩(wěn)定的狀態(tài)。用Western blot方法檢測N蛋白的表達(dá)情況,1h即可以檢測到N蛋白的表達(dá),且N蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量6h有明顯上升,12h后有明顯的下降。通過本研究,成功建立了基于N基因檢測PPRV的實時熒光定量PCR法,并對PPRV N75-1在EEC內(nèi)的增殖規(guī)律進(jìn)行了檢測分析,為深入研究PPRV對山羊生殖系統(tǒng)的損傷機制奠定了實驗基礎(chǔ),對小反芻獸疫防控具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：小反芻獸疫病毒 山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞 熒光定量PCR 增殖規(guī)律 Western blot法
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 文獻(xiàn)綜述11-21
• 第一章 小反芻獸疫概述11-21
• 1.1 病原學(xué)11-12
• 1.2 分子生物學(xué)研究12
• 1.3 病毒的蛋白及其功能12-15
• 1.3.1 M蛋白12
• 1.3.2 N蛋白12-13
• 1.3.3 F蛋白（融合蛋白）13
• 1.3.4 H蛋白（血凝素-神經(jīng)氨酸酶）13
• 1.3.5 L蛋白（大蛋白）13-14
• 1.3.6 P蛋白（磷蛋白）14
• 1.3.7 非結(jié)構(gòu)蛋白14-15
• 1.4 流行病學(xué)15-16
• 1.4.1 易感動物15
• 1.4.2 地理分布15-16
• 1.5 臨床特征及發(fā)病機理16-17
• 1.5.1 臨床癥狀16
• 1.5.2 發(fā)病機理16-17
• 1.6 診斷方法17-18
• 1.6.1 病毒分離17
• 1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗17-18
• 1.6.3 RT-PCR檢測18
• 1.7 疾病防治18-19
• 1.8 展望19-21
• 試驗研究21-38
• 第二章 實時熒光定量PCR檢測PPRV方法的建立21-31
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 細(xì)胞和病毒21
• 2.1.2 菌株和載體21
• 2.1.3 主要試劑21
• 2.1.4 主要儀器21-22
• 2.1.5 常用試劑及溶液的配制22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 病毒增殖22-23
• 2.2.2 引物設(shè)計23
• 2.2.3 提取RNA23
• 2.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建23-25
• 2.2.4.1 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄23
• 2.2.4.2 PCR擴增23-24
• 2.2.4.3 PCR產(chǎn)物的膠回收24
• 2.2.4.4 產(chǎn)物的連接24
• 2.2.4.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化24
• 2.2.4.6 重組質(zhì)粒的提取24-25
• 2.2.4.7 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定及測序25
• 2.2.4.8 計算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)25
• 2.2.5 定量PCR方法的建立25
• 2.2.5.1 擴增曲線25
• 2.2.5.2 溶解曲線25
• 2.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線25
• 2.2.6 熒光定量PCR方法評價25-26
• 2.2.6.1 特異性驗證25
• 2.2.6.2 敏感性驗證25-26
• 2.2.6.3 重復(fù)性驗證26
• 2.3 結(jié)果26-29
• 2.3.1 PCR結(jié)果26
• 2.3.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果26-27
• 2.3.3 基因序列測定分析27
• 2.3.4 計算拷貝數(shù)27
• 2.3.5 擴增曲線的建立27
• 2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立27-28
• 2.3.7 溶解曲線分析28
• 2.3.8 熒光定量PCR方法的評價28-29
• 2.3.8.1 特異性驗證28
• 2.3.8.2 敏感性分析28-29
• 2.3.8.3 重復(fù)性驗證29
• 2.4 討論29-31
• 第三章小反芻獸疫病毒N75-1 株在EEC細(xì)胞上的增殖特性31-38
• 3.1 材料31-33
• 3.1.1 細(xì)胞和病毒31
• 3.1.2 主要試劑31
• 3.1.3 主要溶液的配制31-32
• 3.1.4 主要儀器32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.2.1 EEC細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒的增殖33
• 3.2.1.1 EEC細(xì)胞培養(yǎng)33
• 3.2.1.2 小反芻獸疫N75-1 疫苗毒株擴增培養(yǎng)33
• 3.2.2 N75-1 TCID50的測定33-34
• 3.2.3 EEC細(xì)胞接種疫苗毒N75-1 與病毒增殖定量PCR檢測34
• 3.2.3.1 PPRV接種EEC細(xì)胞定量PCR樣品收集34
• 3.2.3.2 定量PCR檢測34
• 3.2.4 N75-1 疫苗毒株感染EEC細(xì)胞后N蛋白表達(dá)檢測34-35
• 3.3 結(jié)果35-36
• 3.3.1 EEC細(xì)胞接毒前后CPE觀察35
• 3.3.2 PPRV感染EEC細(xì)胞后TCID50的測定35
• 3.3.3 PPRV感染EEC細(xì)胞后增殖規(guī)律35-36
• 3.3.4 PPRV感染EEC細(xì)胞后N蛋白表達(dá)規(guī)律36
• 3.4 討論36-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 縮略詞表43-44
• 致謝44-45
• 作者簡介45

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 杭柏林;胡建和;姚四新;王憲文;王麗榮;王選年;劉興友;;小反芻獸疫病毒蛋白及其功能研究進(jìn)展[J];信陽師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年01期

2 劉玉洪;花群義;徐自忠;楊云慶;周曉黎;董俊;尹尚蓮;許靖逸;高洪;;小反芻獸疫病毒H糖蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2006年09期

3 劉玉洪;徐自忠;花群義;高洪;許靖逸;;小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年12期

4 辛娟;曲素娟;程堯;;小反芻獸疫病毒的研究進(jìn)展[J];當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè);2009年Z1期

5 王凡;劉建斌;祝秀梅;;小反芻獸疫病毒研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年14期

6 蒙學(xué)蓮;才學(xué)鵬;;小反芻獸疫病毒致病性的研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2010年07期

7 蒙學(xué)蓮;竇永喜;翟軍軍;閆豐超;張海瑞;石曉妮;才學(xué)鵬;;小反芻獸疫病毒細(xì)胞膜受體的鑒定[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年09期

8 南文金;王清華;吳曉東;包靜月;王志亮;;小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)與疫苗研究進(jìn)展[J];中國動物檢疫;2009年01期

9 倪偉;才學(xué)鵬;喬軍;孟慶玲;陳創(chuàng)夫;任艷;;小反芻獸疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J];石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年01期

10 龍云鳳;周曉黎;楊俊興;王瓊;祝賀;葉玲玲;董俊;呂建強;王金萍;陳朝銀;花群義;楊仕標(biāo);尹尚蓮;徐維佳;艾軍;;小反芻獸疫病毒核蛋白單克隆抗體的制備與初步應(yīng)用[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2012年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王玉紅;支海兵;黃炯;;小反芻獸疫病毒在兩種Vero細(xì)胞中生長特性的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

2 李偉;李剛;范曉娟;張坤;賈風(fēng)琴;史利軍;Hermann Unger;;小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張國瑞;小反芻獸疫病毒西藏株N基因人工合成、表達(dá)及檢測方法建立的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 翟軍軍;小反芻獸疫病毒全長cDNA的構(gòu)建及DNA疫苗的免疫學(xué)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄧瑞雪;小反芻獸疫病毒囊膜糖蛋白和受體的相互作用研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 王建松;小反芻獸疫病毒N75-1株在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的增殖規(guī)律研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

3 賈鳳芹;小反芻獸疫病毒核衣殼（N）蛋白的原核表達(dá)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

4 張忠湛;小反芻獸疫病毒等溫擴增快速檢測方法的建立[D];吉林大學(xué);2009年

5 楊帆;小反芻獸疫病毒Nigeria 75/1株F基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 田康樂;小反芻獸疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆表達(dá)及單克隆抗體的制備[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

7 劉霞;農(nóng)桿菌介導(dǎo)小反芻獸疫病毒H、F基因轉(zhuǎn)化苜蓿的初步研究[D];青島農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 趙文姬;小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及F基因的分子特性研究[D];揚州大學(xué);2009年

9 惠凱;小反芻獸疫病毒H蛋白的原核表達(dá)與鑒定[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

10 殷倩倩;N蛋白羧基端融合外源表位的小反芻獸疫病毒的構(gòu)建和研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

，

本文編號：542096