本文關(guān)鍵詞：甘氨酰tRNA合成酶調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞NFκB1信號通路研究

  更多相關(guān)文章： 甘氨酰t RNA合成酶 NFκB1 磷酸化 奶牛乳腺上皮細胞 蛋氨酸

【摘要】：本實驗室前期試驗表明,奶牛乳腺上皮細胞中,甘氨酰tRNA合成酶(Gly RS)能接受氨基酸信號,在544位蘇氨酸(threonine,T544)和704位絲氨酸(serine,S704)處磷酸化,進入細胞核,調(diào)節(jié)乳蛋白合成,而其調(diào)節(jié)機制尚未發(fā)現(xiàn)。本試驗旨在揭示GlyRS調(diào)控乳蛋白合成的詳細分子機理。通過添加0.6mmol/L的蛋氨酸(methionine,Met),建立Met促進β-酪蛋白(β-casein,CSN2)合成表達的泌乳模型。檢測此泌乳模型中,NFκB1和p-NFκB1的表達與亞細胞定位。檢測發(fā)現(xiàn)NFκB1在胞漿有分子質(zhì)量141k Da和105k Da兩種形式,而在胞核只有105k Da形式;NFκB1進入細胞核后存在分子剪切,剩下N端部分為p-NFκB1,分子質(zhì)量約為50k Da。細胞在Met促進作用下,NFκB1表達水平有所上升,而且p-NFκB1在胞核內(nèi)定位顯著升高。結(jié)果提示Met通過促進胞漿中NFκB1同IκBα解離進入細胞核,并發(fā)生磷酸化,從而調(diào)控乳合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。研究不同氨基酸處理對p-GlyRS的表達影響,結(jié)果表明添加蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸均能使細胞中p-GlyRS、GlyRS和CSN2的表達顯著上升;在亞細胞定位中發(fā)現(xiàn),GlyRS只存在于胞漿中,而p-GlyRS(T544)和p-GlyRS(S704)在胞漿中均為80kDa形式,在胞核中均為70kDa形式。添加氨基酸之后p-GlyRS在胞核中70k Da形式的定位明顯增加。數(shù)據(jù)表明,氨基酸刺激GlyRS磷酸化,并快速移入核中,被剪切成截短的形式。本研究采用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)鑒定了細胞中NFκB1與GlyRS不結(jié)合,而與p-GlyRS(T544)和p-GlyRS(S704)在胞核中結(jié)合。為研究p-GlyRS是否通過GCN2/e IF2α途徑影響NFκB1基因表達,對GlyRS進行過表達與干擾實驗,Western blotting檢測細胞中NFκB1、e IF2α、GCN2的表達情況和磷酸化水平。結(jié)果表明,氨基酸刺激GlyRS磷酸化入核,抑制GCN2磷酸化,并調(diào)節(jié)NFκB1的轉(zhuǎn)錄激活,從而促進乳蛋白的合成。本研究采用放線菌酮抑制總蛋白合成,觀察在Met信號刺激下,GlyRS、NFκB1、mTOR和Stat5的表達情況和磷酸化水平。結(jié)果顯示,放線菌酮使各蛋白的表達水平降低,添加Met使各蛋白表達水平有所增加。提示GlyRS感應氨基酸信號并不依賴于蛋白質(zhì)翻譯過程。本研究繼續(xù)驗證GlyRS磷酸化是否依賴于mTOR途徑。用雷帕霉素抑制mTOR活性,Western blotting檢測細胞中NFκB1、GlyRS、mTOR及其磷酸化的表達情況。結(jié)果顯示,在雷帕霉素抑制作用下額外添加Met,細胞中GlyRS、p-GlyRS、NFκB1和p-NFκB1表達水平均顯著升高。表明雷帕霉素沒有抑制Met信號下GlyRS和NFκB1的磷酸化,說明GlyRS的磷酸化作用不依賴于mTOR途徑,即m TOR不是GlyRS的上游激酶。綜上所述,氨基酸的促進作用,使GlyRS在T544和S704處磷酸化,進入細胞核,被剪切成了截短的形式,抑制GCN2磷酸化,并與NFκB1結(jié)合,使NFκB1磷酸化并與下游靶基因的增強子位點結(jié)合,從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達。
【關(guān)鍵詞】：甘氨酰t RNA合成酶 NFκB1 磷酸化 奶牛乳腺上皮細胞 蛋氨酸
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 前言14-23
• 1.1 奶牛乳腺發(fā)育與泌乳14
• 1.2 奶牛乳蛋白合成機理14-15
• 1.3 奶牛乳蛋白合成信號轉(zhuǎn)導途徑研究15-17
• 1.3.1 JAK2-STAT5信號通路15-16
• 1.3.2 mTOR信號通路16-17
• 1.4 氨基酸對泌乳的調(diào)節(jié)作用17
• 1.5 NF-κB相關(guān)研究17-19
• 1.5.1 NF-κB的分類17-18
• 1.5.2 NF-κB的功能研究18-19
• 1.6 氨酰t RNA合成酶的功能研究19-21
• 1.6.1 氨酰tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)與功能19-20
• 1.6.2 甘氨酰t RNA合成酶相關(guān)研究20-21
• 1.7 GCN2/e IF2α 途徑相關(guān)研究21
• 1.7.1 e IF2α 相關(guān)研究21
• 1.7.2 GCN2相關(guān)研究21
• 1.8 實驗目的與意義21-23
• 2 材料與方法23-40
• 2.1 實驗材料23-28
• 2.1.1 主要實驗試劑23-24
• 2.1.2 主要實驗儀器24
• 2.1.3 實驗動物與細胞24
• 2.1.4 主要溶液的配制24-28
• 2.2 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)純化與鑒定28-31
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)與純化28-29
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的鑒定29-31
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮細胞的凍存31
• 2.3 添加蛋氨酸的奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的建立31-32
• 2.4 添加蛋氨酸后乳腺上皮細胞中NFκB1和p-NFκB1的表達與亞細胞定位32
• 2.4.1 IF法檢測添加蛋氨酸后細胞中NFκB1和p-NFκB1的表達與亞細胞定位32
• 2.4.2 WB法檢測添加蛋氨酸后細胞中NFκB1和p-NFκB1的表達與亞細胞定位32
• 2.5 不同氨基酸處理對磷酸化GlyRS蛋白表達水平上的影響32-33
• 2.5.1 不同氨基酸處理對磷酸化GlyRS總蛋白表達水平上的影響32-33
• 2.5.2 不同氨基酸對磷酸化GlyRS胞漿和胞核蛋白水平上的影響33
• 2.6 免疫共沉淀分析NFκB1與GlyRS的相互作用33-34
• 2.6.1 胞漿蛋白和胞核蛋白的提取與純度鑒定33
• 2.6.2 免疫共沉淀分析NFκB1與GlyRS的相互作用33-34
• 2.7 p-GlyRS與GCN2/e IF2α 途徑的關(guān)系研究34-38
• 2.7.1 GlyRS過表達對GCN2/e IF2α 途徑的影響34-37
• 2.7.2 GlyRS抑制對GCN2/e IF2α 途徑的影響37-38
• 2.8 蛋白質(zhì)翻譯過程和mTOR途徑對GlyRS磷酸化的影響38
• 2.8.1 蛋白質(zhì)翻譯過程對GlyRS磷酸化的影響38
• 2.8.2 mTOR途徑對GlyRS磷酸化的影響38
• 2.9 統(tǒng)計分析38-40
• 3 結(jié)果與分析40-57
• 3.1 乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)、純化及其鑒定40-41
• 3.1.1 乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)、純化40-41
• 3.1.2 乳腺上皮細胞的鑒定41
• 3.2 添加蛋氨酸的奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的建立41-42
• 3.3 添加蛋氨酸后乳腺上皮細胞中NFκB1和p-NFκB1的表達與亞細胞定位42-46
• 3.3.1 IF檢測添加蛋氨酸后細胞中NFκB1和p-NFκB1的表達與定位42-44
• 3.3.2 WB檢測添加蛋氨酸后細胞中NFκB1和p-NFκB1的表達與定位44-46
• 3.4 氨基酸處理對乳腺上皮細胞中磷酸化GlyRS的影響46-48
• 3.4.1 總蛋白水平上氨基酸處理對磷酸化GlyRS的影響46-47
• 3.4.2 胞漿和胞核蛋白水平上不同氨基酸對磷酸化GlyRS的影響47-48
• 3.5 NFκB1與GlyRS相互作用48-49
• 3.5.1 胞漿和胞核的提取與純度鑒定48
• 3.5.2 NFκB1與GlyRS相互作用驗證48-49
• 3.6 p-GlyRS與GCN2/e IF2α 途徑的關(guān)系研究49-55
• 3.6.1 GlyRS過表達對GCN2/e IF2α 途徑的影響49-53
• 3.6.2 GlyRS抑制對對GCN2/e IF2α 途徑的影響53-55
• 3.7 蛋白質(zhì)翻譯過程和mTOR途徑對GlyRS磷酸化的影響55-57
• 3.7.1 蛋白質(zhì)翻譯過程對GlyRS磷酸化的影響55
• 3.7.2 mTOR途徑對GlyRS磷酸化的影響55-57
• 4 討論57-60
• 4.1 奶牛乳腺上皮細胞添加蛋氨酸泌乳模型中NFκB1的表達與亞細胞定位57
• 4.2 添加氨基酸對奶牛乳腺上皮細胞中p-GlyRS的影響57-58
• 4.3 p-GlyRS與GCN2/eIF2α 途徑的關(guān)系58
• 4.4 蛋白質(zhì)翻譯和mTOR途徑對GlyRS磷酸化的影響58-60
• 5 結(jié)論60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻62-70
• 附錄70-71
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文71

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本文編號：532064