本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒M蛋白在桿狀病毒中的表達(dá)、純化及生物學(xué)特性初步研究

  更多相關(guān)文章： 狂犬病病毒 基質(zhì)蛋白 桿狀病毒 表達(dá)和純化 致病性

【摘要】：狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)引起的一種人獸共患病。人和大多數(shù)溫血動物易感,臨床上以怕光,精神沉郁,進(jìn)行性麻痹和最終死亡為主要特征,致死率幾乎100%。RV有N、P、M、G和L共5種結(jié)構(gòu)蛋白,其中,G蛋白是決定RV致病性的關(guān)鍵蛋白。許多研究表明G蛋白某些氨基酸位點的突變會改變RV的致病性以及病毒的一些生物學(xué)屬性,如胞間擴散,膜融合,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。而RV其它蛋白對其致病性是否有影響卻知之甚少。2006年,Shimizu K等人利用反向遺傳學(xué)技術(shù)把Ni-CE(由固定毒株Nishigahara在雞胚成纖維細(xì)胞中連續(xù)傳100代后獲得的,對成年小鼠無致病性)M蛋白基因替換成Nishigahara株(固定毒株,腦內(nèi)接種可致死成年小鼠)M蛋白基因后,重組病毒CE(NiM)重新獲得了致病力,腦內(nèi)接種可致死成年小鼠。此結(jié)果為人們對RV致病機制的深入研究打開了新的篇章。因此,從多個角度進(jìn)一步探討M蛋白對RV致病性的影響對于明確RV的致病機制和有效防控狂犬病具有重要意義。本研究以探討單獨的M蛋白接種對RV致病性的影響為目的,進(jìn)行了如下試驗:1.表達(dá)狂犬病病毒M蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建和鑒定。試驗內(nèi)容:(1)以RT-PCR技術(shù)擴增狂犬病病毒BD06株M蛋白基因;(2)將M蛋白基因序列插入桿狀病毒載體質(zhì)粒pFast Bac I中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pFast Bac I-M;(3)用鑒定正確的重組質(zhì)粒pFast Bac I-M轉(zhuǎn)化DH10 Bac E.coli感受態(tài)菌,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-M,并以PCR法鑒定;(4)以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-M轉(zhuǎn)染Sf 9昆蟲細(xì)胞,獲取重組桿狀病毒AcMNPV-M,取細(xì)胞病變上清,以電鏡觀察重組病毒形態(tài);(5)用小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體、兔抗RV陽性血清和犬抗RV陽性血清通過Western Blot方法鑒定重組M蛋白的表達(dá)及其反應(yīng)原性。2.重組M蛋白的純化及多克隆抗體的制備。試驗內(nèi)容:(1)利用鎳離子親和層析柱純化重組M蛋白;(2)用純化的重組M蛋白免疫大耳白兔,每次免疫后1周,耳緣靜脈采血并分離血清;(3)通過Western Blot試驗分析兔抗M蛋白多克隆抗體同狂犬病病毒ag株、pv2061株、srv9株、cvs-11株、era株和bd06株m蛋白之間是否存在交叉反應(yīng);(4)以favn試驗測定兔抗m蛋白多克隆抗體是否具有病毒中和活性。3.m蛋白生物學(xué)特性初步研究。以探索接種m蛋白后對腦內(nèi)與外周攻毒小鼠潛伏期、發(fā)病率的影響為目的。具體試驗步驟如下:(1)將實驗動物隨機分為腦內(nèi)攻毒組和外周攻毒組兩個大組,兩組中又分別設(shè)立了高劑量攻毒組和低劑量攻毒組;(2)將純化的m蛋白與等體積油佐劑混合后分別于0d,7d,14d通過腹腔注射免疫四個大組中的小鼠,同時大組內(nèi)設(shè)立透析液組、acmnpv組作為對照;(3)第3次免疫后,于第5天對小鼠進(jìn)行斷尾采血并分離血清,用westernblot試驗分析重組m蛋白免疫原性;(4)第3次免疫后1周,對兩大組小鼠分別進(jìn)行腦內(nèi)和外周肌肉注射攻毒試驗,攻毒后連續(xù)觀察14天,記錄小鼠攻毒后的潛伏期、發(fā)病數(shù)以及死亡數(shù)。通過以上試驗,獲得以下結(jié)果:1.成功構(gòu)建了重組桿狀病毒acmnpv-m,且該重組病毒電鏡下具有典型的桿狀病毒形態(tài),其感染sf9昆蟲細(xì)胞后,通過sds-page試驗鑒定,重組桿狀病毒表達(dá)了一約25kd的蛋白,用小鼠抗his標(biāo)簽單抗、兔抗rv陽性血清和犬抗rv陽性血清通過westernblot試驗對其反應(yīng)原性鑒定,在25kd附近也出現(xiàn)了單一的條帶。2.變性條件下純化的重組m蛋白sds-page條帶單一,純度良好;透析復(fù)性后,以該純化m蛋白免疫大耳白兔制備的兔抗m蛋白多克隆抗體與現(xiàn)有主要狂犬病疫苗株及流行毒株m蛋白反應(yīng)性能良好,westernblot鑒定結(jié)果顯示在25kd左右均出現(xiàn)了一特異性條帶;favn試驗結(jié)果顯示,兔抗m蛋白多克隆抗體的病毒中和效價為0。3.小鼠攻毒試驗結(jié)果顯示,單獨接種m蛋白后,腦內(nèi)接種3ld50或50ld50狂犬病病毒cvs-24株時,不同小組動物的潛伏期、發(fā)病和死亡率均無明顯差異;外周接種100ld50狂犬病病毒bd06株時,acmnpv-m組的小鼠全部發(fā)病,透析液組和acmnpv組小鼠死亡率為80%(8/10);外周接種3ld50狂犬病病毒bd06株時,acmnpv-m組、透析液組和acmnpv組的小鼠均無發(fā)病。通過以上研究結(jié)果,得出以下結(jié)論:1.成功構(gòu)建了重組桿狀病毒acmnpv-m,且該重組病毒表達(dá)的m蛋白具有良好的反應(yīng)原性,為后續(xù)研究m蛋白其它生物學(xué)特性奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。2.可用鎳離子親和層析法對桿狀病毒表達(dá)的M蛋白進(jìn)行純化;重組M蛋白免疫原性良好;制備的兔抗M蛋白多克隆抗體與現(xiàn)有狂犬病疫苗株及流行毒株均有良好反應(yīng)性;M蛋白誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體無病毒中和活性。3.單獨的M蛋白接種對不同組別中腦內(nèi)攻毒小鼠的潛伏期、發(fā)病率和死亡率的均無明顯影響;對不同劑量外周攻毒的小鼠的潛伏期也無明顯影響,但有提升小鼠的發(fā)病率的趨勢。提示單獨接種M蛋白可能會影響狂犬病病毒致病性。論文創(chuàng)新點:1.利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了狂犬病病毒BD06M蛋白,建立了純化方法,制備了抗M蛋白多克隆抗體,為深入研究M蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。2.探索了單獨的狂犬病病毒M蛋白接種對狂犬病病毒致病性的影響,為進(jìn)一步明確狂犬病病毒致病機制提供了基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 基質(zhì)蛋白 桿狀病毒 表達(dá)和純化 致病性
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 英文縮寫詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一章 狂犬病病毒M蛋白在桿狀病毒中的表達(dá)及鑒定15-35
• 1 材料與方法15-28
• 1.1 材料15-19
• 1.2 方法19-28
• 2 結(jié)果28-32
• 2.1 狂犬病病毒BD06株M蛋白全基因序列的擴增28-29
• 2.2 重組質(zhì)粒pFast Bac I-M的雙酶切鑒定29
• 2.3 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-M的PCR鑒定29-30
• 2.4 重組桿狀病毒AcMNPV-M的拯救30
• 2.5 重組桿狀病毒AcMNPV-M的鑒定30-31
• 2.6 重組M蛋白的鑒定31-32
• 3 討論32-33
• 3.1 目的基因的選擇32-33
• 3.2 表達(dá)系統(tǒng)的選擇33
• 4.小結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-35
• 第二章 重組M蛋白的純化及多克隆抗體的制備35-41
• 1 材料與方法35-38
• 1.1 材料35-36
• 1.2 方法36-38
• 2 結(jié)果38-39
• 2.1 重組M蛋白的純化38
• 2.2 兔抗M多克隆抗體的反應(yīng)原性鑒定38-39
• 2.3 兔抗M多克隆抗體的FAVN檢測結(jié)果39
• 3 討論39-40
• 4 小結(jié)40-41
• 第三章 狂犬病病毒M蛋白生物學(xué)特性的初步研究41-46
• 1 材料和方法41-42
• 1.1 材料41
• 1.2 方法41-42
• 2 結(jié)果42-45
• 2.1 攻毒前血清中抗M蛋白抗體的反應(yīng)原性測定42-43
• 2.2 小鼠攻毒試驗43-45
• 3 討論45
• 4 小結(jié)45-46
• 個人簡歷46-47
• 致謝47

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韓改會;李回;孟先明;羅廷榮;;狂犬病病毒L蛋白的研究進(jìn)展[J];廣西畜牧獸醫(yī);2010年02期

2 張茂林;關(guān)振宏;段銘;黃英玉;王歡平;孟銳奇;;幾種糖對4℃貯存狂犬病病毒穩(wěn)定性的影響[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2010年05期

3 梁秀梅，，于潛;狂犬病病毒和狂犬病[J];生物學(xué)通報;1994年06期

4 陳鵬峰;也談犬與狂犬病[J];上海實驗動物科學(xué);1995年02期

5 ;應(yīng)用免疫熒光抗體技術(shù)檢測豬的狂犬病病毒[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;1997年09期

6 張海,金昌德,李六金,施新猷,婁清林,李秦;狂犬病病毒3aG株糖蛋白重組質(zhì)粒構(gòu)建及其體液免疫的研究[J];中國獸醫(yī)科技;2002年03期

7 姜海龍;錢愛東;;狂犬病病毒糖/核融合基因原核表達(dá)克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與分析[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2005年06期

8 李影;段銳;錢愛東;;鹿源狂犬病野毒8202株基因型的研究[J];經(jīng)濟動物學(xué)報;2005年04期

9 張永振;熊成龍;鄒洋;王定明;余春;周敬祝;王昭孝;張永榮;;貴州省安龍縣狂犬病的流行病學(xué)研究[J];Virologica Sinica;2006年04期

10 王群亮;;淺析狂犬病防控工作出現(xiàn)的問題及對策[J];科技信息(學(xué)術(shù)研究);2006年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁繼超;張海林;章域震;楊衛(wèi)紅;馮云;李浩;唐青;;云南省狂犬病病毒分子流行病學(xué)研究[A];2010全國狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

2 羅廷榮;;廣西狂犬病流行現(xiàn)狀[A];2010全國狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

3 周鵬;徐靜東;王曉娟;趙s

本文編號：530932