本文關(guān)鍵詞：豬miR-155兩種基因型的性狀關(guān)聯(lián)分析的研究

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【摘要】：微小RNA(microRNA)是非編碼RNA中最為人們熟悉的一個(gè)亞類,它廣泛的參與發(fā)育,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增值。miR-155在免疫系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育及調(diào)控中扮演重要角色,其宿主基因上關(guān)鍵位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致miR-155表達(dá)量的改變,從而引起下游免疫系統(tǒng)的差異。我們根據(jù)miR-155宿主基因BIC(B-cell Integration Cluster)上的SNP信息,利用PCR-RFLP方法在中外培育品種豬中鑒定了兩種基因型個(gè)體,利用流式細(xì)胞術(shù)分選調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,Treg)以進(jìn)行后續(xù)基因表達(dá)差異試驗(yàn)驗(yàn)證,同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析了其中一個(gè)關(guān)鍵SNP的基因型與杜洛克×二花臉F2資源群體的免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)性,具體結(jié)果如下:(1)不同豬種兩種基因型個(gè)體的鑒定在miR-155宿主基因BIC上,我們將miR-155前體的第一個(gè)堿基以+1表示,上游305bp的A/C突變以-305bp表示,我們根據(jù)-305A/C這個(gè)SNP信息,在三個(gè)中外培育品種中尋找兩種基因型個(gè)體。通過對(duì)55頭蘇鐘豬、300鄂通兩頭烏和250頭湖北白豬進(jìn)行PCR-RFLP分析,在鄂通兩頭烏中挑選得到4頭AA型個(gè)體和3頭CC型個(gè)體,在湖北白豬中挑選到2頭AA型個(gè)體和2頭CC型個(gè)體。在鄂通兩頭烏群體中,AA基因型頻率為0.0348,AC基因型頻率為0.4609,CC基因型頻率為0.5043。A的基因頻率為0.2653,C的基因頻率為0.7347。在湖北白豬群體中,AA基因型頻率為0.8279,AC基因型頻率為0.1680,CC基因型頻率為0.0041。A的基因頻率為0.9119,C的基因頻率為0.0881。在檢測(cè)的55頭蘇鐘豬中,沒有發(fā)現(xiàn)CC型。AA基因型頻率為0.6545,AC基因型頻率為0.3455。A的基因頻率為0.8273,C的基因頻率為0.1727。(2)兩種基因型豬血常規(guī)性狀差異分析利用Beckman Coulter Ac.Tdiff 2血細(xì)胞分析儀對(duì)兩種基因型的鄂通兩頭烏進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),將4頭AA基因型個(gè)體和3頭CC基因型個(gè)體的血液指標(biāo)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩種基因型豬間,紅細(xì)胞平均體量(MCV,f L)存在差異(P0.05),紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW,%)存在顯著差異(P0.01)。(3)MiR-155上游305A/C突變與F2群體一些免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析根據(jù)miR-155上游305bp的A/C突變對(duì)杜洛克×二花臉F2資源群體共計(jì)394頭個(gè)體進(jìn)行分型,并在不同時(shí)間點(diǎn)與該群體的免疫指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:在F2群體中,AA基因型頻率為0.2507,AC基因型頻率為0.5171,CC基因型頻率為0.2321。A的基因頻率為0.5092,C的基因頻率為0.4908。在20日齡時(shí),miR-155前體上游305A/C突變對(duì)CD4-CD8+CD3-,CD4-CD8+CD3+細(xì)胞有顯著影響(P0.05)。在33日齡時(shí),mi R-155前體上游305 A/C變異對(duì)紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞比容(HCT)和血紅蛋白含量(HGB)有顯著影響(p0.05),對(duì)血小板體積分布寬度(PDW)和血小板平均體積(MPV)有極顯著影響(p0.01)。在35日齡時(shí),該SNP對(duì)血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)有顯著影響(p0.05),對(duì)血小板體積分布寬度(PDW)有極顯著影響(p0.01)。在80日齡時(shí),對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(EO),嗜酸性粒細(xì)胞比率(EOP)有顯著影響(p0.05)。該位點(diǎn)可能影響miR-155的表達(dá),從而在個(gè)體生長(zhǎng)的不同時(shí)間點(diǎn),調(diào)控不同的通路,影響不同類型的免疫細(xì)胞的發(fā)育。(4)兩種基因型豬的Treg細(xì)胞分選利用流式細(xì)胞儀和三種不同熒光標(biāo)記的抗體分選不同基因型豬的Treg。先根據(jù)總白細(xì)胞中不同細(xì)胞的物理參數(shù)(大小,濃度等)的不同分選出淋巴細(xì)胞,設(shè)置一個(gè)門,再?gòu)倪@個(gè)門中分選出CD3+的細(xì)胞類群,再?gòu)闹羞x取CD4+細(xì)胞,最后再?gòu)腃D4+T細(xì)胞中選擇CD25+細(xì)胞,最終得到Treg細(xì)胞,流式細(xì)胞分析結(jié)果表明豬Treg細(xì)胞占總白細(xì)胞的1%左右。(5)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-155對(duì)其靶基因的作用通過轉(zhuǎn)染mimic155到豬的巨噬細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)了miR-155對(duì)四種靶基因的mRNA表達(dá)水平的影響不顯著。本研究初步證明了miR-155宿主基因BIC上的SNP突變與一些免疫指標(biāo)存在關(guān)聯(lián)。miR-155對(duì)其靶基因的作用可能是轉(zhuǎn)錄后水平。該研究為揭示兩種基因型豬之間的免疫能力差異提供了理論依據(jù),同時(shí)為豬相關(guān)性狀分子育種提供了新的分子標(biāo)記。
【關(guān)鍵詞】：豬 SNP 免疫指標(biāo) Treg miR-155 靶基因
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 縮略詞表（ABBREVIATIONS）11-12
• 1 前言12-21
• 1.1 研究問題的由來(lái)12-13
• 1.2 MicroRNA在免疫系統(tǒng)中的作用13-16
• 1.2.1 MicroRNA研究現(xiàn)狀13
• 1.2.2 MicroRNA對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)育的作用13-15
• 1.2.3 MicroRNA調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的信號(hào)通路15
• 1.2.4 MicroRNA點(diǎn)突變?cè)诿庖咧械难芯窟M(jìn)展15-16
• 1.3 MiR-155與免疫的關(guān)系16-18
• 1.3.1 MiR-155對(duì)免疫系統(tǒng)的作用16-17
• 1.3.2 MiR-155靶基因的研究進(jìn)展17-18
• 1.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究進(jìn)展18-20
• 1.4.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫功能18-19
• 1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的研究進(jìn)展19
• 1.4.3 Foxp3直接靶向miR-155調(diào)節(jié)Treg19-20
• 1.5 研究的目的與意義20-21
• 2 技術(shù)路線、材料及方法21-27
• 2.1 技術(shù)路線21
• 2.2 材料21-23
• 2.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物群體21-22
• 2.2.2 細(xì)胞系22
• 2.2.3 主要試驗(yàn)試劑22
• 2.2.4 主要生化試劑的配置22-23
• 2.2.5 主要數(shù)據(jù)庫(kù)和生物學(xué)軟件23
• 2.3 方法23-27
• 2.3.1 SNP關(guān)聯(lián)分析23-24
• 2.3.2 兩種基因型個(gè)體血常規(guī)檢測(cè)24-25
• 2.3.3 流式細(xì)胞儀分選豬Treg25
• 2.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)26
• 2.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，，所用統(tǒng)計(jì)軟件及統(tǒng)計(jì)模型26-27
• 3 結(jié)果與分析27-42
• 3.1 兩種基因型個(gè)體差異的研究27-33
• 3.1.1 A/C兩種基因型個(gè)體鑒定27-29
• 3.1.2 兩種基因型豬血常規(guī)T檢驗(yàn)分析29-31
• 3.1.3 流式細(xì)胞儀分選兩種基因型豬的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞31-33
• 3.2 miR-155的研究33-42
• 3.2.1 miR-155前體上游 305bp SNP與免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析33-40
• 3.2.2 mimic155轉(zhuǎn)染細(xì)胞后靶基因表達(dá)量的探究40-42
• 4 討論42-47
• 4.1 關(guān)于三種中外培育品種豬基因型頻率的討論42
• 4.2 關(guān)于miR-155結(jié)構(gòu)與功能的討論42-45
• 4.2.1 miR-155調(diào)節(jié)造血進(jìn)程與AA/CC基因型血常規(guī)差異討論42-43
• 4.2.2 miR-155調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)育及關(guān)聯(lián)分析結(jié)果討論43-44
• 4.2.3 關(guān)于mimic155轉(zhuǎn)染細(xì)胞后靶基因表達(dá)量差異的討論44-45
• 4.3 關(guān)于Treg分選的討論45
• 4.3.1 關(guān)于Treg分選結(jié)果的討論45
• 4.4 關(guān)于下一步工作的計(jì)劃45-47
• 5 小結(jié)47-49
• 5.1 本研究的主要結(jié)果47
• 5.2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)與特色47-48
• 5.3 本研究的不足之處以及有待解決的問題48-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 致謝57-58

【相似文獻(xiàn)】

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1 楊龍龍;miR-155在創(chuàng)面愈合中的作用及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 李健;miR-155真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在胰腺癌中功能的初步研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

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1 單舒文;豬miR-155兩種基因型的性狀關(guān)聯(lián)分析的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 饒明禮;MiR-155在正常妊娠及妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者胎盤中的表達(dá)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

3 李凝詩(shī);冠心病患者外周血miR-155及miR-146a表達(dá)與冠脈斑塊形態(tài)的相關(guān)性[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2014年

4 張余琴;鼻咽癌中miR-155功能的初探[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：526349