本文關(guān)鍵詞：shRNA-DCN調(diào)控鴨肌肉生長發(fā)育的分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Decorin 鴨 成肌細(xì)胞 shRNA

【摘要】：核心蛋白聚糖(Decorin)是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸軟骨素蛋白聚糖家族的一員,在肌肉細(xì)胞分化、遷移和調(diào)節(jié)結(jié)締組織形成的過程中發(fā)揮著重要的作用。肌肉的生長發(fā)育與蛋白代謝過程密切相關(guān),多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了肌肉蛋白代謝過程。哺乳動物中的研究表明,Decorin是TGF-β的胞外配體,可通過該信號通路影響細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)移。DCN通過抑制MSTN來促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化,還能夠通過抑制IGF1 R的活性、激活A(yù)KT等調(diào)控肌肉的生長發(fā)育。在鴨中,DCN是否可通過TGF-β/Smad和IGF1/P13K/AKTIMTOR通路來實(shí)現(xiàn)對肌肉生長發(fā)育的調(diào)控過程,目前還不明確。因此,本研究通過構(gòu)建DCN基因的干擾載體,分別將其轉(zhuǎn)染至鴨成肌細(xì)胞及雛鴨腿肌中,同時(shí)采用PI3K基因的激活劑重組人胰島素樣生長因子□(Recombinant human insulin-like growth factors□, RH IGF1)處理鴨成肌細(xì)胞。通過用CCK-8法檢測細(xì)胞的活性,用組織石蠟切片法觀察肌肉的生長發(fā)育狀態(tài),分別用qRT-PCR法和ELISA法檢測TGF-β/Smad和IGF1/PI3K/AKT/MTOR信號通路中基因的表達(dá)量,以期得到沉默DCN基因在細(xì)胞和個(gè)體水平上對鴨肌肉生長發(fā)育的調(diào)控及其途徑。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)構(gòu)建了鴨DCN基因干擾載體shRNA1、shRNA2、shRNA3和陰性對照載體shControl。轉(zhuǎn)染至鴨成肌細(xì)胞后,成功篩選出干擾效果較好的載體shRNA3和最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間24h。qRT-PCR和ELISA檢測結(jié)果顯示,在鴨成肌細(xì)胞和雛鴨腿肌中轉(zhuǎn)染該干擾載體可使DCN得到抑制。鴨DCN基因的shRNA最佳干擾序列為5’CGCAGACACCAACATTACTAG3’。(2)分別用shRNA-DCN和shControl處理鴨成肌細(xì)胞,培養(yǎng)24h后用qRT-PCR和ELISA法檢測相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示shRNA-DCN處理組與shControl處理組相比,成肌細(xì)胞的活性明顯下降,且IGF1 R、PI3K、AKT、MTOR、 p70S6K、MYOD、TGF-β R1和Smad4基因以及Decorin、P13K、MTOR、TGF-β R1和Smad2蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.05)。表明沉默DCN基因可通過IGF1/PI3K/IAKTIMTOR/p70S6K信號通路和TGF-β/Smad信號通路抑制鴨成肌細(xì)胞的增殖。(3)用shRNA-DCN處理鴨成肌細(xì)胞,同時(shí)向培養(yǎng)液中添加RH IGF1 (20ng/mL),培養(yǎng)24小時(shí)后用qRT-PCR和ELISA法檢測相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與shRNA-DCN處理組相比,shRNA-DCN+IGF1處理組中成肌細(xì)胞的活性明顯增加,且GF1 R、AKT、 MTOR、p70S6K和Smad4基因以及Decorin、PI3K、MTOR、 TGF-βR1和Smad2蛋白的表達(dá)量顯著升高(p0.05)。表明RH IGF1可通過IGF1/PI3K/AKT/MTOR/p70S6K信號通路和TGF-β/Smad信號通路緩解DCN基因沉默對成肌細(xì)胞增殖活性的抑制。(4)在雛鴨腿肌中沉默DCN基因后,使IGF1/PI3K/AKT/MTOR/p70S6K信號通路和TGF-β/Smad信號通路中IGF1R、MTOR、S6K、TGFβR1和Smad4等基因的表達(dá)水平降低,但并未導(dǎo)致肌纖維直徑和密度發(fā)生顯著變化,推測這可能與個(gè)體生長發(fā)育過程中自我修復(fù)的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：Decorin 鴨 成肌細(xì)胞 shRNA
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S834
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 常用詞語英文縮寫9-12
• 前言12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 DCN的結(jié)構(gòu)與功能12-15
• 1.1.1 DCN的結(jié)構(gòu)13
• 1.1.2 DCN的生物學(xué)功能13-15
• 1.2 肌肉的生長發(fā)育及其調(diào)控通路15-20
• 1.3 Decorin對肌肉生長發(fā)育的調(diào)控作用20-22
• 1.4 研究的目的意義22-23
• 2 材料與方法23-31
• 2.1 試驗(yàn)材料23
• 2.1.1 試驗(yàn)樣品處理及采集23
• 2.1.2 試劑耗材23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-31
• 2.2.1 DCN基因干擾載體的構(gòu)建24
• 2.2.2 質(zhì)粒的擴(kuò)繁及提取24-25
• 2.2.3 熒光定量引物的設(shè)計(jì)與合成25-26
• 2.2.4 成肌細(xì)胞的培養(yǎng)26-28
• 2.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞的活性28
• 2.2.6 shRNA處理雛鴨及樣品的采集28-29
• 2.2.7 總RNA的提取及cDNA的合成29-30
• 2.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測30-31
• 2.2.9 ELISA法檢測蛋白含量31
• 3 結(jié)果與分析31-43
• 3.1 構(gòu)建干擾載體31-32
• 3.2 shRNA-DCN對成肌細(xì)胞的影響32-39
• 3.2.1 DCN基因干擾載體的篩選32-34
• 3.2.2 PI3K激活劑RH IGF1處理成肌細(xì)胞時(shí)間點(diǎn)分析34
• 3.2.3 shRNA-DCND對成肌細(xì)胞增殖的調(diào)控分析34-38
• 3.2.4 RH IGF1緩解shRNA-DCN的抑制作用38-39
• 3.3 沉默DCN基因?qū)喭燃〉挠绊?/span>39-43
• 3.3.1 轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)的篩選39-40
• 3.3.2 shRNA-DCN對相關(guān)基因表達(dá)的影響40
• 3.3.3 shRNA-DCN對腿肌發(fā)育的影響40-43
• 4 討論43-48
• 4.1 DCN對成肌細(xì)胞增殖和分化的影響43-44
• 4.2 DCN調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化的信號通路44-46
• 4.3 肌肉生長發(fā)育過程中IGF1與DCN的關(guān)系46
• 4.4 DCN對肌肉生長發(fā)育的影響46-48
• 5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 致謝57-58
• 碩士研究生學(xué)習(xí)期間發(fā)表文章58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙微;薛建華;;小鼠成肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立與優(yōu)化[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2008年04期

2 皇甫一凡;昝林森;王洪寶;成功;劉揚(yáng);高建斌;李耀坤;楊寧;;胰島素誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞成脂分化的研究[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年03期

3 葛昕;李亞明;竇忠英;;外源性rhCNTF抑制成人成肌細(xì)胞體外分化作用及其信號機(jī)制[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2010年09期

4 高明鞠;高素敏;于靜;鄭金;楊在清;雷霆;;FAD24對小鼠成肌細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)作用[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

5 湯展毅;嚴(yán)云勤;高學(xué)軍;陸黎敏;朱丹丹;冀志庚;;牛myf6基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在成肌細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年13期

6 劉晨曦;唐森;李文蓉;劉明軍;;綿羊MSTN基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對成肌細(xì)胞的分化作用[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年05期

7 吳丹;胡蘭;;MSTN RNAi雙元表達(dá)載體對成肌細(xì)胞增殖及分化的影響[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

8 付銳;范晶晶;崔勝;劉佳利;;睪酮通過不同信號通路影響骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和分化[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

9 姬改革;陶志云;朱春紅;劉宏祥;李慧芳;;鴨胚胎期成肌細(xì)胞IGF-IR基因mRNA的表達(dá)與分析[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年03期

10 李粉;王麗;鄭艷艷;陳華群;;C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)肌性分化過程中miR-101a的表達(dá)[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李美山;張成;張雅妮;王淑輝;于美娟;熊符;尚延昌;彭福寧;;成肌細(xì)胞促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子的研究[A];第九次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2006年

2 朱文輝;王予彬;華詠;符雪蓮;;成年犬骨骼肌成肌細(xì)胞的體外簡易培養(yǎng)法[A];第十七屆中國內(nèi)鏡醫(yī)師大會論文集[C];2007年

3 吳海濤;陳曉萍;劉紅;劉淑紅;范明;;CNTF對在體和離體成肌細(xì)胞作用的比較[A];中國生理學(xué)會第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會全國學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2003年

4 何等旗;唐休發(fā);華成舸;馮揚(yáng);李小玉;;兩種不同來源成肌細(xì)胞存活率的比較研究[A];第五次全國口腔頜面—頭頸腫瘤學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2006年

5 周建大;羅成群;賀全勇;李文波;陳繼業(yè);李明;;成人成肌細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)[A];美麗人生 和諧世界——中華醫(yī)學(xué)會第七次全國醫(yī)學(xué)美學(xué)與美容學(xué)術(shù)年會、中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)美學(xué)與美容學(xué)分會20周年慶典暨第三屆兩岸四地美容醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文匯編[C];2010年

6 何等旗;唐休發(fā);華成舸;馮揚(yáng);;人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞及其表達(dá)[A];海峽兩岸2008口腔癌診治與修復(fù)重建新進(jìn)展研討會論文集[C];2008年

7 米少華;盧永昕;榮書玲;劉啟云;蘇冠華;;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)人胰島素樣生長因子Ⅰ在大鼠成肌細(xì)胞中的表達(dá)及分泌[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

8 陳曉萍;劉紅;吳海濤;劉淑紅;吳燕;范明;;睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對成人成肌細(xì)胞的抑分化作用及其機(jī)理[A];中國生理學(xué)會第六屆全國青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2003年

9 王奎鵬;馮國清;胡香杰;;巴戟天寡糖對成肌細(xì)胞增殖及分化的影響[A];全國第十一屆生化與分子藥理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

10 喬東訪;路艷蒙;傅文玉;李佩英;樸英杰;;5-氮胞苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的鑒定[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 吳一福;成肌細(xì)胞移植可激活抑制心肌細(xì)胞恢復(fù)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

2 董映璧;胚胎成肌細(xì)胞可治心跳過慢[N];科技日報(bào);2005年

3 劉 向;德利用自體成肌細(xì)胞治療心肌梗死[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2004年

4 記者 田學(xué)科;科學(xué)家弄清肌肉發(fā)育中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[N];科技日報(bào);2007年

5 毛天球;組織工程學(xué)研究概況[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

6 陸志城;肌干細(xì)胞——再續(xù)神奇[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Mahmood Nazari;腺相關(guān)病毒（AAV）過表達(dá)Follistatin在綿羊成肌細(xì)胞中的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

2 Md.Shahjahan;肉雞2個(gè)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的多態(tài)性與功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 羅文;miRNAs介導(dǎo)的信號通路對雞成肌細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

4 汪璇;白介素6類細(xì)胞因子對成人成肌細(xì)胞增殖和分化影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

5 高輝;雷帕霉素對成肌細(xì)胞治療骨骼肌損傷的影響及其作用機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2014年

6 丁可;基因修飾成肌細(xì)胞結(jié)合可注射溫敏凝膠支架構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

7 陳疾忤;聯(lián)合應(yīng)用攜hIFNγ基因與攜hIGF-1基因的成肌細(xì)胞治療小鼠骨骼肌損傷[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

8 孫天威;組織工程化肌及成肌細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

9 張力;骨碎補(bǔ)總黃酮促進(jìn)轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞成骨分化及引導(dǎo)性骨再生的研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2012年

10 唐浩;轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞治療慢性心肌梗死實(shí)驗(yàn)研究—體外實(shí)驗(yàn)部分[D];中南大學(xué);2003年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉瑞鑿;肉用綿羊IncRNA特征分析及細(xì)胞水平功能驗(yàn)證[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 馮芾;MiR-145對C2C12成肌細(xì)胞增殖的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 王浩瀚;過表達(dá)Six1對鴨成肌細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響及調(diào)控途徑初探[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 趙陽玫;瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 李杰;MiR-127-3p在C2C12成肌細(xì)胞增殖和分化的作用及調(diào)控機(jī)制的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 術(shù)蓉;體外炎性條件下成肌細(xì)胞/分化肌管的免疫特性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

7 唐嘯寅;miR-340-5p靶向Bai3、ROCK1、DMD及其對成肌細(xì)胞的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 夏盼;長非編碼RNA-AK004418對成肌細(xì)胞增殖和分化的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

9 李桂煥;MiR-223靶向IGF2和ZEB1調(diào)控家禽成肌細(xì)胞的增殖和分化[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 楊雪;牛TDGF1基因?qū)Τ杉〖?xì)胞增殖作用的分子機(jī)制研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

，

本文編號：518351