本文關(guān)鍵詞：豬CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羥化代謝的關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定

  更多相關(guān)文章： 豬 T-2毒素 CYP3A家族 分子對(duì)接 定點(diǎn)突變

【摘要】：細(xì)胞色素P450氧化酶(Cytochrome P450,CYP)是由一類(lèi)與結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的同工酶構(gòu)成的亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白超家族,廣泛存在于自然界的生物體中。它參與內(nèi)源性物質(zhì)的氧化、過(guò)氧化以及還原代謝作用和包括臨床上90%的藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝。T-2毒素是單端孢霉烯族化合物中性質(zhì)最穩(wěn)定、毒性最強(qiáng)的毒素之一,廣泛分布于玉米、小麥和食品添加劑中。喂食被T-2毒素污染的飼料能使畜禽中毒,嚴(yán)重者甚至死亡。毒素在畜禽體內(nèi)的代謝物可以通過(guò)農(nóng)副產(chǎn)品間接威脅到人類(lèi)的健康。而豬是我國(guó)農(nóng)場(chǎng)和消費(fèi)市場(chǎng)占有量最大的動(dòng)物之一,它更容易受到T-2毒素的污染和毒害。羥化反應(yīng)是T-2毒素在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生的主要代謝反應(yīng)之一,也是影響其毒性大小的關(guān)鍵反應(yīng)之一。前期的研究發(fā)現(xiàn),在豬體內(nèi),CYP 3A家族基因(CYP3A22、CYP3A46和CYP3A29)能催化T-2毒素或HT-2毒素發(fā)生羥化反應(yīng)。其中CYP3A29催化T-2毒素羥化代謝成3’-OH-T-2的關(guān)鍵位點(diǎn)已經(jīng)初步闡明,然而CYP3A22和CYP3A46的羥化代謝T-2毒素的關(guān)鍵位點(diǎn)尚不清楚。目的和手段:本研究將通過(guò)異源表達(dá)、純化、計(jì)算機(jī)同源建模、分子對(duì)接、定點(diǎn)突變和活性檢測(cè)等方法,在體外獲得天然構(gòu)象、穩(wěn)定活性的豬的CYP 3A家族蛋白的基礎(chǔ)上,特別是對(duì)CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羥化代謝中的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行深入研究。結(jié)果:1、通過(guò)不同異源表達(dá)體系的摸索和優(yōu)化,最終在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系中獲得了具有穩(wěn)定催化T-2毒素羥化代謝能力的豬CYP3A家族蛋白;2、在豬CYP3A家族與T-2毒素分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)中,初步篩選出CYP3A22可能發(fā)揮羥化代謝的關(guān)鍵位點(diǎn)為Met-57、Arg-105、Arg-106、Ser-119、Arg-212、Phe-213、Asp-214、Phe-215、Ala-305、ILe-301、Thr-309、ILe-369、Ala-370、Ala-371、Arg-372、GLy-481和Ile-483這17個(gè)殘基,其中Phe-213、Thr-309和Gly-481 3個(gè)殘基多次與T-2毒素分子形成氫鍵。CYP3A46可能發(fā)揮羥化代謝的關(guān)鍵位點(diǎn)為Phe-108、Phe-304、Pro-371、Ala-305、Thr-370、Lys-212、Phe-215、Phe-213、Arg-372、Arg-106、Arg-105、Glu-374和Leu-373這13個(gè)殘基,其中Lys-215、Phe-213和Glu-374 3個(gè)殘基多次與T-2毒素分子形成氫鍵。3、對(duì)豬CYP3A46催化T-2毒素羥化代謝中的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)F213A、F215A和E374A突變體羥化代謝T-2毒素能力喪失;R106A、F108A和T370A這三個(gè)突變體代謝能力下降非常顯著;突變體K212A代謝產(chǎn)物量也有減少,約為野生型的75%。以上結(jié)果提示Arg-106、Phe-108、Phe-213、Phe-215、Thr-370和Glu-374是影響T-2毒素羥化代謝的關(guān)鍵位點(diǎn),Lys-212可能是影響T-2毒素進(jìn)入活性區(qū)域的位點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：豬 T-2毒素 CYP3A家族 分子對(duì)接 定點(diǎn)突變
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞7-10
• 1 前言10-20
• 1.1 細(xì)胞色素P450氧化酶概述10-12
• 1.1.1 細(xì)胞色素P450氧化酶的命名與分布10
• 1.1.2 細(xì)胞色素P450氧化酶的結(jié)構(gòu)特征及催化機(jī)制10-11
• 1.1.3 細(xì)胞色素P450氧化酶在藥物代謝中的作用11-12
• 1.2 CYP3A家族簡(jiǎn)介12-14
• 1.2.1 CYP3A4簡(jiǎn)介12-14
• 1.3 細(xì)胞色素P450氧化酶研究的生物信息學(xué)方法14-15
• 1.4 細(xì)胞色素P450氧化酶異源表達(dá)系統(tǒng)15-17
• 1.4.1 大腸桿菌表達(dá)體系15
• 1.4.2 酵母表達(dá)體系15-16
• 1.4.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)16
• 1.4.4 病毒表達(dá)體系16-17
• 1.5 T-2 毒素17-19
• 1.5.1 T-2 毒素的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)17-18
• 1.5.2 T-2 毒素代謝轉(zhuǎn)化18
• 1.5.3 T-2 毒素與細(xì)胞色素P450氧化酶18-19
• 1.6 本研究的目的、意義及實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計(jì)19-20
• 2 材料與方法20-35
• 2.1 材料20-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源20
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品21
• 2.1.4 主要試劑21-23
• 2.1.5 生物信息學(xué)分析工具23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-35
• 2.2.1 CYP3A22原核表達(dá)23-25
• 2.2.2 CYP3A22酵母表達(dá)25-27
• 2.2.3 蛋白同源比對(duì)27-28
• 2.2.4 CYP3A46及其突變體真核表達(dá)載體構(gòu)建28-30
• 2.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.2.6 S9組分提取31-35
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)分析35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析35-49
• 3.1 CYP3A22原核系統(tǒng)表達(dá)35-38
• 3.2 CYP3A22酵母系統(tǒng)表達(dá)38
• 3.3 CYP3A真核表達(dá)38-41
• 3.4 人CYP3A4和豬CYP3A家族蛋白的同源對(duì)比41-43
• 3.5 CYP3A22和CYP3A46三維結(jié)構(gòu)模擬模型43
• 3.6 分子對(duì)接43-44
• 3.7 CYP3A46與T-2 毒素羥化反應(yīng)活性位點(diǎn)分析44-45
• 3.7.1 CYP3A46突變載體構(gòu)建44-45
• 3.8 CYP3A46突變體真核表達(dá)45-46
• 3.8.1 CYP3A46真核表達(dá)45-46
• 3.9 CYP3A46及其突變體與T-2 毒素代謝差異46-49
• 4 討論49-53
• 4.1 CYP3A22蛋白的原核表達(dá)體系總結(jié)49-50
• 4.2 CYP3A家族與T-2 毒素對(duì)接結(jié)果50-51
• 4.3 CYP3A結(jié)構(gòu)與功能分析51-53
• 5 總結(jié)53-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Ni-ni Lin;Jia Chen;Bin Xu;Xia Wei;Lei Guo;Jian-wei Xie;;The roles of carboxylesterase and CYP isozymes on the in vitro metabolism of T-2 toxin[J];Military Medical Research;2015年01期

2 周曉菲;馮曉聲;張乃生;周昌芳;馮曉群;;T-2毒素及其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和心肌毒性研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年12期

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本文編號(hào)：516452