本文關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備及效果觀察

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【摘要】：犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染普遍存在于世界各地犬科動(dòng)物中,引起較高的發(fā)病率和死亡率,導(dǎo)致養(yǎng)犬業(yè)及寵物業(yè)經(jīng)濟(jì)損失慘重,對(duì)野生動(dòng)物的生存也產(chǎn)生了非常大的影響,而目前對(duì)該病尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療對(duì)策,疫苗的開發(fā)免疫是有效預(yù)防CPV流行的關(guān)鍵,但CPV存在抗原漂移,所以根據(jù)CPV流行和抗原特異性來制備相應(yīng)的滅活疫苗,對(duì)預(yù)防目前國(guó)內(nèi)CPV的流行意義重大。本試驗(yàn)首先將實(shí)驗(yàn)室近來分離保存的CPV-S5(New CPV-2a基因亞型)與CPV-1401(New CPV-2b基因亞型)毒株分別在F81細(xì)胞上擴(kuò)大培養(yǎng),通過病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)確定CPV的最佳生長(zhǎng)條件,以此培養(yǎng)較高滴度且足夠量的病毒液來制備濃縮與未濃縮滅活疫苗;接著通過高濃度鹽離心濃縮與小型切向流超濾濃縮兩種濃縮方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮;之后將濃縮的病毒液與未濃縮的病毒液與終濃度為0.05%β-丙內(nèi)脂4℃條件滅活24h,37℃水浴2h;經(jīng)在F81細(xì)胞上進(jìn)行滅活鑒定后,參考本實(shí)驗(yàn)室劉曉慧制備疫苗的方法,將水溶性佐劑MONTANIDE GEL和滅活病毒液按1:9比例混合,再通過無菌及理化性質(zhì)的鑒定,結(jié)果顯示所做的三批疫苗所用的病毒液均滅活成功,無菌鑒定陰性,外觀透明無渾濁現(xiàn)像,免疫犬后均未見明顯的臨床副反應(yīng),且有效的刺激犬產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,表明成功制備了安全、有效的濃縮CPV與未濃縮CPV水溶劑滅活疫苗。將第一批水溶劑滅活疫苗和商品化犬細(xì)小弱毒苗分別接種5周齡未免疫且HI抗體效價(jià)陰性的幼犬,分別在免疫后0 d、7d、14 d、21d、28 d通過HI試驗(yàn)對(duì)處理過的血清進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定,結(jié)果顯示所有免疫組在第7d都能產(chǎn)生高于1:80的HI抗體效價(jià),濃縮組要顯著高于未濃縮組,初步表明CPV滅活疫苗效果與抗原的濃度有直接的關(guān)系;滅活疫苗組與商品化弱毒苗組均差異顯著。對(duì)試驗(yàn)犬免疫36d后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),攻毒后20d內(nèi),免疫組的犬均未見明顯臨床癥狀,僅2只犬產(chǎn)生輕微癥狀但最終耐過,而HI抗體效價(jià)陰性犬死亡,經(jīng)檢測(cè)死亡犬CPV為陽性,表明制備的CPV滅活疫苗產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答能抵抗強(qiáng)毒的攻擊,對(duì)犬起到很好的免疫保護(hù)。對(duì)攻毒過后的犬繼續(xù)加強(qiáng)免疫第二批滅活疫苗,加強(qiáng)免疫10d后對(duì)所有犬CPV檢測(cè),過后取高免血清,結(jié)果顯示CPV陰性且高免血清平均HI效價(jià)為1:3072。滅活疫苗首免抗體效價(jià)及持續(xù)時(shí)間有限需加強(qiáng)免疫,故首免36d后進(jìn)行二免,結(jié)果顯示其HI抗體效價(jià)極顯著提高,有效抗體能維持6個(gè)月,進(jìn)一步有效的對(duì)免疫犬群進(jìn)行保護(hù)。將第三批水溶劑滅活疫苗分別接種3月齡未免疫且HI效價(jià)陰性的比格犬,分別在7d、14 d、21d、28 d通過HI試驗(yàn)對(duì)處理過的血清進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定,結(jié)果顯示犬在第7d的HI抗體效價(jià)達(dá)到1:448,其抗體消長(zhǎng)規(guī)律與第一批濃縮CPV-S5滅活疫苗組總趨勢(shì)一樣,表明制備的滅活疫苗免疫效果重復(fù)性較穩(wěn)定,且進(jìn)一步證明其免疫效果與抗原濃度有直接關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：犬細(xì)小病毒 滅活疫苗 免疫效果
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.292
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 前言12-17
• 1.1 CPV生物學(xué)特性12-13
• 1.2 CPV的分子生物學(xué)特性13
• 1.3 CPV抗原檢測(cè)研究13-14
• 1.3.1 電鏡觀察13
• 1.3.2 血凝試驗(yàn)（HA）13-14
• 1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）14
• 1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）14
• 1.4 CPV抗體檢測(cè)研究14-15
• 1.4.1 血凝抑制試驗(yàn)（HI）14
• 1.4.2 中和試驗(yàn)（SN）14-15
• 1.5 CPV的預(yù)防治療15
• 1.6 疫苗研究進(jìn)展15-16
• 1.6.1 弱毒疫苗與滅活疫苗15-16
• 1.6.2 基因工程疫苗與核酸疫苗16
• 1.7 本研究目的與意義16-17
• 2 材料與方法17-27
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 細(xì)胞、毒株和商品化疫苗17
• 2.1.2 主要試劑及耗材17
• 2.1.3 主要儀器17-18
• 2.1.4 培養(yǎng)基及主要溶液的配制18-19
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.2 方法19-27
• 2.2.1 疫苗的制備及免疫預(yù)防19-27
• 2.2.1.1 引物設(shè)計(jì)19
• 2.2.1.2 F81細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)與凍存19-20
• 2.2.1.3 CPV培養(yǎng)接毒量和生長(zhǎng)曲線的確定20
• 2.2.1.4 CPV的鑒定20-22
• 2.2.1.5 病毒的增殖培養(yǎng)22
• 2.2.1.6 HA抗原制備22
• 2.2.1.7 HA實(shí)驗(yàn)22
• 2.2.1.8 病毒的濃縮22-23
• 2.2.1.9 病毒的滅活23
• 2.2.1.10 CPV滅活效果檢測(cè)23
• 2.2.1.11 滅活CPV與佐劑混合23-24
• 2.2.1.12 疫苗的檢驗(yàn)24-25
• 2.2.1.13 CPV滅活疫苗免疫25-26
• 2.2.1.14 免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)26
• 2.2.1.15 第三批疫苗免疫26-27
• 2.2.2 高免血清的制備27
• 2.2.2.1 免疫方案27
• 2.2.2.2 HI檢測(cè)抗體水平27
• 2.2.2.3 頸動(dòng)脈插管放血27
• 2.2.2.4 高免血清的處理27
• 2.2.3 數(shù)據(jù)處理27
• 3 結(jié)果與分析27-40
• 3.1 CPV的增殖27-28
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)液PCR檢測(cè)28-29
• 3.3 CPV生長(zhǎng)曲線的確定29-30
• 3.4 病毒的濃縮30-31
• 3.5 CPV的滅活效果檢驗(yàn)31
• 3.6 滅活疫苗的制備31
• 3.7 滅活疫苗實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)31-32
• 3.7.1 無菌檢驗(yàn)31-32
• 3.7.2 穩(wěn)定性與劑型檢測(cè)32
• 3.8 抗體消長(zhǎng)規(guī)律32-36
• 3.9 二免后抗體消長(zhǎng)規(guī)律36-37
• 3.10 攻毒實(shí)驗(yàn)37-39
• 3.10.1 攻毒劑量37-38
• 3.10.2 攻毒結(jié)果38
• 3.10.3 攻毒后犬糞便PCR檢測(cè)38-39
• 3.11 第三批疫苗的免疫效果39
• 3.12 高免血清制備39-40
• 4 討論40-44
• 4.1 CPV滅活疫苗的制備40-41
• 4.2 CPV滅活疫苗的免疫效果41-44
• 全文總結(jié)44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 附錄：攻讀碩士期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文50

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本文編號(hào)：511396