發(fā)布時(shí)間：2017-06-30 19:01

  本文關(guān)鍵詞：豬TRIM11基因克隆及其對(duì)豬偽狂犬病毒增殖影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：TRIM蛋白是以三基序結(jié)構(gòu)(也叫做RBCC結(jié)構(gòu)域)為特點(diǎn)的蛋白家族,TRIM蛋白參與了各種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞增殖,分化,癌癥發(fā)生以及凋亡等。許多TRIM蛋白可以作為固有免疫的組分或直接與病毒組分作用調(diào)控病毒的感染過程。TRIM11是TRIM蛋白家族的一員,對(duì)于人TRIM11的研究發(fā)現(xiàn)TRIM11可以抑制HIV-1的侵入,復(fù)制與釋放,發(fā)揮抗病毒作用,又可以負(fù)調(diào)控IRF3的激活促進(jìn)HSV-1的感染,可見TRIM11在病毒感染過程中有著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于豬TRIM11基因的研究很少,本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬TRIM11的PK15細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究豬TRIM11的生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。為了研究豬TRIM11對(duì)偽狂犬病毒感染的作用,本研究從豬頜下淋巴結(jié)cDNA中擴(kuò)增出豬TRIM11編碼序列,對(duì)TRIM11基因進(jìn)行分析,進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建真核表達(dá)載體PB-TRIM11并將重組載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞,通過嘌呤霉素篩選及qRT-PCR鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。用0.1 MOI PRV感染過表達(dá)TRIM11PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對(duì)照組細(xì)胞,分別于感染后0 h,12 h,24 h,36 h收獲細(xì)胞上清,檢測(cè)PRV的滴度(TCID50)。用0.1 MOI PRV感染PK15細(xì)胞,于感染后0 h,12 h,24 h,36 h收獲細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測(cè)TRIM11轉(zhuǎn)錄水平的變化。用0.1 MOI PRV感染過表達(dá)TRIM11 PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對(duì)照組細(xì)胞,同時(shí)設(shè)不感染PRV對(duì)照,于感染后12 h收獲細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測(cè)IFN-β轉(zhuǎn)錄水平的變化。用IFN-β-Luc轉(zhuǎn)染過表達(dá)TRIM11 PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對(duì)照組細(xì)胞,之后兩組細(xì)胞接種0.1 MOI PRV,同時(shí)設(shè)不接種病毒對(duì)照組,于感染后12 h收獲細(xì)胞,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β啟動(dòng)子活性的變化。結(jié)果表明,豬TRIM11的ORF長度為1407 bp,編碼468個(gè)氨基酸,蛋白分子量53 kDa,等電點(diǎn)為5.409,其蛋白有3個(gè)TRIM家族保守的結(jié)構(gòu)域,這三個(gè)結(jié)構(gòu)域從N端到C端的順序依次是RING結(jié)構(gòu)、2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域、一個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil domain)。此外該蛋白C端結(jié)構(gòu)域?yàn)樽畛Ｒ姷腜RY結(jié)構(gòu)域和SPRY結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)譜分析的結(jié)果顯示,豬TRIM11基因在脂肪組織、肺的表達(dá)量較高,而在心臟,回腸,十二指腸,直腸中的表達(dá)量較低�；驕y(cè)序結(jié)果顯示克隆的豬TRIM11 cDNA序列正確并成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PB-TRIM11,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明TRIM11在PK15細(xì)胞系中成功表達(dá)。檢測(cè)感染PRV后過表達(dá)TRIM11 PK15細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞上清液病毒的TCID50發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM11組的病毒滴度始終高于對(duì)照組,這種差異在12 h時(shí)更明顯(P0.05)。提示,過表達(dá)TRIM11促進(jìn)了PRV的增殖,這種作用在PRV感染早期更顯著。PRV感染可以抑制PK15細(xì)胞中TRIM11的轉(zhuǎn)錄水平。TRIM11過表達(dá)促進(jìn)了PRV感染過程中PK15細(xì)胞IFN-β的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：豬TRIM11基因 載體構(gòu)建 PK15細(xì)胞系 豬偽狂犬病毒
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-7
• 摘要7-8
• 1 文獻(xiàn)綜述8-19
• 1.1 抗病毒固有免疫反應(yīng)中感受器和信號(hào)通路概述8-12
• 1.1.1 TLRs8-9
• 1.1.2 胞質(zhì)RNA感受器9
• 1.1.3 胞質(zhì)DNA感受器9-10
• 1.1.4 TBK110
• 1.1.5 IRFs10-12
• 1.2 三基序結(jié)合蛋白(TRIM)家族12-16
• 1.2.1 TRIM蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.2.2 TRIM蛋白家族參與固有免疫及在病毒感染中的調(diào)節(jié)作用13-15
• 1.2.3 TRIM1115-16
• 1.3 豬偽狂犬病毒(PRV)16-17
• 1.4 展望17-19
• 2 引言19-20
• 3 材料方法20-28
• 3.1 試驗(yàn)材料20
• 3.2 主要試劑20
• 3.3 主要儀器20
• 3.4 主要溶液及其配制20-21
• 3.5 豬TRIM11基因的生物信息學(xué)分析、克隆與真核表達(dá)載體構(gòu)建21-24
• 3.5.1 豬TRIM11基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析21
• 3.5.2 豬TRIM11基因的組織分布21-22
• 3.5.3 豬TRIM11基因的克隆22
• 3.5.4 PB-TRIM11表達(dá)載體構(gòu)建22-24
• 3.6 PB-TRIM11穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞系的構(gòu)建24-25
• 3.7 TRIM11在PRV增殖中的生物學(xué)活性研究25-26
• 3.7.1 豬偽狂犬病毒(PRV strain Bartha K16)的擴(kuò)大培養(yǎng)25
• 3.7.2 所制病毒TCID50測(cè)定25
• 3.7.3 過表達(dá)TRIM11對(duì)PRV增殖的影響25
• 3.7.4 病毒感染后TRIM11轉(zhuǎn)錄水平的變化25-26
• 3.7.5 過表達(dá)TRIM11在PRV增殖中對(duì)IFN-β 的影響26
• 3.8 數(shù)據(jù)處理26-28
• 4 結(jié)果與分析28-36
• 4.1 豬TRIM11基因的生物信息學(xué)分析28-30
• 4.1.1 豬TRIM11基因的序列分析及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域模式28-29
• 4.1.2 豬TRIM11基因在不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化分析29-30
• 4.2 熒光定量PCR分析豬TRIM11基因的組織特異性30
• 4.3 豬TRIM11基因的克隆30-31
• 4.4 真核表達(dá)載體PB-TRIM11的構(gòu)建31-32
• 4.5 豬TRIM11在PK15細(xì)胞中的表達(dá)32-33
• 4.5.1 PB-TRIM11轉(zhuǎn)染PK15的熒光顯微鏡觀察32
• 4.5.2 豬TRIM11基因過表達(dá)32-33
• 4.6 豬TRIM11生物學(xué)作用初步研究33-36
• 4.6.1 PRV的培養(yǎng)及TCID50測(cè)定33-34
• 4.6.2 過表達(dá)豬TRIM11對(duì)PRV病毒增殖的影響34-35
• 4.6.3 PRV感染后PK15細(xì)胞中TRIM11轉(zhuǎn)錄水平下降35
• 4.6.4 TRIM11過表達(dá)促進(jìn)PRV誘導(dǎo)的IFN-β 的激活35-36
• 5 結(jié)論與討論36-39
• 5.1 討論36-38
• 5.1.1 豬TRIM11基因克隆與組織分布36-37
• 5.1.2 真核表達(dá)載體PB-TRIM11的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞37
• 5.1.3 過表達(dá)豬TRIM11對(duì)PRV病毒增殖的影響37-38
• 5.2 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-47
• 英文摘要47-48

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：豬TRIM11基因克隆及其對(duì)豬偽狂犬病毒增殖影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：503060