本文關(guān)鍵詞：豬TRIM11基因克隆及其對豬偽狂犬病毒增殖影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：TRIM蛋白是以三基序結(jié)構(gòu)(也叫做RBCC結(jié)構(gòu)域)為特點的蛋白家族,TRIM蛋白參與了各種細胞過程,包括細胞增殖,分化,癌癥發(fā)生以及凋亡等。許多TRIM蛋白可以作為固有免疫的組分或直接與病毒組分作用調(diào)控病毒的感染過程。TRIM11是TRIM蛋白家族的一員,對于人TRIM11的研究發(fā)現(xiàn)TRIM11可以抑制HIV-1的侵入,復(fù)制與釋放,發(fā)揮抗病毒作用,又可以負(fù)調(diào)控IRF3的激活促進HSV-1的感染,可見TRIM11在病毒感染過程中有著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于豬TRIM11基因的研究很少,本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達豬TRIM11的PK15細胞系,為進一步研究豬TRIM11的生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。為了研究豬TRIM11對偽狂犬病毒感染的作用,本研究從豬頜下淋巴結(jié)cDNA中擴增出豬TRIM11編碼序列,對TRIM11基因進行分析,進行了組織表達譜分析和系統(tǒng)進化分析。利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建真核表達載體PB-TRIM11并將重組載體轉(zhuǎn)染PK15細胞,通過嘌呤霉素篩選及qRT-PCR鑒定獲得穩(wěn)定表達細胞系。用0.1 MOI PRV感染過表達TRIM11PK15細胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對照組細胞,分別于感染后0 h,12 h,24 h,36 h收獲細胞上清,檢測PRV的滴度(TCID50)。用0.1 MOI PRV感染PK15細胞,于感染后0 h,12 h,24 h,36 h收獲細胞,提取細胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測TRIM11轉(zhuǎn)錄水平的變化。用0.1 MOI PRV感染過表達TRIM11 PK15細胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對照組細胞,同時設(shè)不感染PRV對照,于感染后12 h收獲細胞,提取細胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測IFN-β轉(zhuǎn)錄水平的變化。用IFN-β-Luc轉(zhuǎn)染過表達TRIM11 PK15細胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對照組細胞,之后兩組細胞接種0.1 MOI PRV,同時設(shè)不接種病毒對照組,于感染后12 h收獲細胞,用雙熒光素酶報告基因檢測IFN-β啟動子活性的變化。結(jié)果表明,豬TRIM11的ORF長度為1407 bp,編碼468個氨基酸,蛋白分子量53 kDa,等電點為5.409,其蛋白有3個TRIM家族保守的結(jié)構(gòu)域,這三個結(jié)構(gòu)域從N端到C端的順序依次是RING結(jié)構(gòu)、2個B-box結(jié)構(gòu)域、一個卷曲結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil domain)。此外該蛋白C端結(jié)構(gòu)域為最常見的PRY結(jié)構(gòu)域和SPRY結(jié)構(gòu)域。組織表達譜分析的結(jié)果顯示,豬TRIM11基因在脂肪組織、肺的表達量較高,而在心臟,回腸,十二指腸,直腸中的表達量較低。基因測序結(jié)果顯示克隆的豬TRIM11 cDNA序列正確并成功構(gòu)建了真核表達載體PB-TRIM11,qRT-PCR檢測結(jié)果表明TRIM11在PK15細胞系中成功表達。檢測感染PRV后過表達TRIM11 PK15細胞和對照組細胞上清液病毒的TCID50發(fā)現(xiàn)過表達TRIM11組的病毒滴度始終高于對照組,這種差異在12 h時更明顯(P0.05)。提示,過表達TRIM11促進了PRV的增殖,這種作用在PRV感染早期更顯著。PRV感染可以抑制PK15細胞中TRIM11的轉(zhuǎn)錄水平。TRIM11過表達促進了PRV感染過程中PK15細胞IFN-β的表達。
【關(guān)鍵詞】：豬TRIM11基因 載體構(gòu)建 PK15細胞系 豬偽狂犬病毒
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-7
• 摘要7-8
• 1 文獻綜述8-19
• 1.1 抗病毒固有免疫反應(yīng)中感受器和信號通路概述8-12
• 1.1.1 TLRs8-9
• 1.1.2 胞質(zhì)RNA感受器9
• 1.1.3 胞質(zhì)DNA感受器9-10
• 1.1.4 TBK110
• 1.1.5 IRFs10-12
• 1.2 三基序結(jié)合蛋白(TRIM)家族12-16
• 1.2.1 TRIM蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.2.2 TRIM蛋白家族參與固有免疫及在病毒感染中的調(diào)節(jié)作用13-15
• 1.2.3 TRIM1115-16
• 1.3 豬偽狂犬病毒(PRV)16-17
• 1.4 展望17-19
• 2 引言19-20
• 3 材料方法20-28
• 3.1 試驗材料20
• 3.2 主要試劑20
• 3.3 主要儀器20
• 3.4 主要溶液及其配制20-21
• 3.5 豬TRIM11基因的生物信息學(xué)分析、克隆與真核表達載體構(gòu)建21-24
• 3.5.1 豬TRIM11基因序列和系統(tǒng)進化分析21
• 3.5.2 豬TRIM11基因的組織分布21-22
• 3.5.3 豬TRIM11基因的克隆22
• 3.5.4 PB-TRIM11表達載體構(gòu)建22-24
• 3.6 PB-TRIM11穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK15細胞系的構(gòu)建24-25
• 3.7 TRIM11在PRV增殖中的生物學(xué)活性研究25-26
• 3.7.1 豬偽狂犬病毒(PRV strain Bartha K16)的擴大培養(yǎng)25
• 3.7.2 所制病毒TCID50測定25
• 3.7.3 過表達TRIM11對PRV增殖的影響25
• 3.7.4 病毒感染后TRIM11轉(zhuǎn)錄水平的變化25-26
• 3.7.5 過表達TRIM11在PRV增殖中對IFN-β 的影響26
• 3.8 數(shù)據(jù)處理26-28
• 4 結(jié)果與分析28-36
• 4.1 豬TRIM11基因的生物信息學(xué)分析28-30
• 4.1.1 豬TRIM11基因的序列分析及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)域模式28-29
• 4.1.2 豬TRIM11基因在不同物種間的系統(tǒng)進化分析29-30
• 4.2 熒光定量PCR分析豬TRIM11基因的組織特異性30
• 4.3 豬TRIM11基因的克隆30-31
• 4.4 真核表達載體PB-TRIM11的構(gòu)建31-32
• 4.5 豬TRIM11在PK15細胞中的表達32-33
• 4.5.1 PB-TRIM11轉(zhuǎn)染PK15的熒光顯微鏡觀察32
• 4.5.2 豬TRIM11基因過表達32-33
• 4.6 豬TRIM11生物學(xué)作用初步研究33-36
• 4.6.1 PRV的培養(yǎng)及TCID50測定33-34
• 4.6.2 過表達豬TRIM11對PRV病毒增殖的影響34-35
• 4.6.3 PRV感染后PK15細胞中TRIM11轉(zhuǎn)錄水平下降35
• 4.6.4 TRIM11過表達促進PRV誘導(dǎo)的IFN-β 的激活35-36
• 5 結(jié)論與討論36-39
• 5.1 討論36-38
• 5.1.1 豬TRIM11基因克隆與組織分布36-37
• 5.1.2 真核表達載體PB-TRIM11的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK15細胞37
• 5.1.3 過表達豬TRIM11對PRV病毒增殖的影響37-38
• 5.2 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-47
• 英文摘要47-48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉曜綜;芮萍;馬芮;馬增軍;;偽狂犬病毒固有免疫逃避機制[J];病毒學(xué)報;2015年06期

2 李小靜;唐滿華;;豬偽狂犬病病毒在不同細胞上的增殖研究[J];吉林畜牧獸醫(yī);2015年06期

3 Sufang LU;Guangjun GUO;Ling MO;Feng WEI;Bingmei DONG;Wentong ZHANG;Zhiqiang SHEN;;Establishment and Application of a SYBR Green I Real-time Quantitative PCR Assay for the Detection of LAT Gene of Pseudorabies Virus in Bama Miniature Pigs[J];Agricultural Biotechnology;2015年03期

4 熊安洲;陳菁;曹艷;胡小萍;;非小細胞肺癌中PAX6表達及其對腫瘤細胞增殖與侵襲作用機制研究[J];中國癌癥雜志;2014年08期

5 劉昒;趙琴平;董惠芬;蔣明森;;TGF-β信號傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能[J];中國病原生物學(xué)雜志;2014年01期

6 于正洪;姜恩澤;張杰明;陳龍邦;;PiggyBac轉(zhuǎn)座子:人類基因編碼研究的新工具[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2014年02期

7 曹光;劉豐亮;張高紅;鄭永唐;;靈長類動物中TRIMCyp融合基因模式及對逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的限制作用[J];動物學(xué)研究;2012年01期

8 齊巍巍;張艷麗;閆益波;鐘部帥;王鋒;;干擾素調(diào)節(jié)因子1的研究進展[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年02期

9 謝飛;蔣世忠;馬晴雯;;piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在哺乳動物及其細胞中的研究進展[J];生命科學(xué);2011年03期

10 楊毅;李文剛;饒寶;張永濤;呂玉金;;豬偽狂犬病疫苗的研究進展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報;2010年03期

  本文關(guān)鍵詞：豬TRIM11基因克隆及其對豬偽狂犬病毒增殖影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：503060