本文關鍵詞：江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定與耐藥模式分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛最常發(fā)生的疾病之一,它對牛場造成巨大的經濟負擔,對公共健康而言也是潛在的危機。病原菌感染是奶牛乳房炎最主要的病因。本研究采用傳統(tǒng)方法從乳房炎奶樣中進行病原菌分離、純化,并從分離菌株藥物敏感性和耐藥基因兩方面用生物統(tǒng)計學進行分析,總結主要分離菌——葡萄球菌的耐藥模式,而后進一步對其中部分耐藥基因失效的原因進行探究。主要內容如下：一、江蘇地區(qū)奶牛乳房炎的流行病原調查以及葡萄球菌的分離純化本研究在江蘇地區(qū)采集了2012年3月至2014年3月的CMT檢測陽性的630份奶樣,其中有544個奶樣檢出細菌,利用傳統(tǒng)的分離方法分離出825株,其中葡萄球菌393株,其檢出率為47.63%；鏈球菌237株,其檢出率為28.73%；桿菌190株,其檢出率為23.03%；另有5株左氏無綠藻,其檢出率為0.6%,進行藥敏試驗結果顯示只有慶大霉素對左氏無綠藻有較好的抑制效果。二、乳房炎葡萄球菌的耐藥模式探究針對其中主要的分離菌葡萄球菌,根據其表型耐藥能力和耐藥基因上分析耐藥模式。根據CLSI的建議,使用紙片擴散法檢測了其對15種不同抗生素的表型耐藥能力,并用PCR檢測了其中tetK、tetM、tetL、tetO、ermC、blaZ的分離率。本試驗中84.73%的葡萄球菌對青霉素耐藥,為耐藥性最強的抗菌藥物,其余依次為頭孢他啶(47.58%)、諾氟沙星(36.13%)；而敏感性最好的抗菌藥物是氯霉素(86.2%),其他依次是呋喃妥因(84.98%)、克拉霉素(79.39%)。在多重耐藥上看,CNS的耐藥性較多集中在雙重抗性上,而SA在四重耐藥是最集中的。而后根據卡方分析該地區(qū)葡萄球菌總體上的表型的耐藥模式,發(fā)現針對干擾核酸代謝的藥物,SA的耐藥能力顯著強于CNS；針對影響蛋白合成的抗生素,CNS的耐藥性顯著強于SA。這是目前耐藥性研究中首次利用卡方檢驗從藥物原理方向上去總結其耐藥性特征。從基因利導的耐藥模式上分析,六種耐藥基因在CNS上的檢出率都明顯高于SA,但是所有耐藥基因在SA中的有效性可達100%,CNS則不能。三分之一的CNS能對p-內酰胺藥物耐藥的機制在于其能產生p-內酰胺酶,CNS針對四環(huán)素的耐藥則主要在于tetK、tetL介導的蛋白泵機制,其中依賴于tetK的比重最大。但是,只有四分之一的SA針對β-內酰胺藥物耐藥的機制在于其能產生p-內酰胺酶,而其他耐藥基因擴增率則都很低。三、葡萄球菌中部分耐藥基因失效原因的探究該研究中發(fā)現了其中部分菌株具有相關耐藥基因但并不能有效耐藥,菌株雖然不多,但是確實存在的。本研究主要從該類基因的堿基序列分析中著手去探究原因。將這些特殊基因和相應有耐藥性的基因連接T載體送測序分析,結果表明,在擴增的blaZ基因中,七個無耐藥性菌株的blaZ基因與具有耐藥性菌株的blaZ基因序列相比具有很大差異,且在GenBank中未能搜索到結果,因此判定這七個序列應該是具有其他未知作用但目前尚未報道過的基因,同時該基因在本研究中其他葡萄球菌中并沒有擴增得到,因此判定其在葡萄球菌中應該為非必要的基因。同樣無耐藥性的特殊基因tetK和tetL同實際上存在的有耐藥性的tetK和tetL同源性很高,因此我們將它們都與PGEM-6P-1載體連接,檢測耐藥性。發(fā)現在擴增的tetK基因中,取自tetK有耐藥性的陽性克隆株都對四環(huán)素表現耐藥,但取自四環(huán)素敏感菌株MP00109中的tetK基因轉化的克隆株依舊沒有出現耐藥性,說明這個tetK基因中出現的5個位點的突變很可能是其中的關鍵位點。而取自MP00101的tetK基因的克隆菌株則在抑菌圈內部有部分細菌生長,說明在其中還存在抗藥的潛力,這點與MP00101中只有一個位點的突變相符,說明該位點決定的耐藥性在抗生素的壓力下存在回復突變的可能或是有其他位點的改變可以彌補缺失的耐藥性；在擴增的tetL基因中,在菌株MP00213和MP00350中有效的tetL基因在克隆轉化BL21后,轉化菌對四環(huán)素只表現出了中介,四環(huán)素敏感菌株MP00368中的tetL克隆轉化菌對四環(huán)素依舊呈現了敏感,因此推測該基因在BL21菌株中依舊起到了一定影響作用。綜上所述可知,在江蘇地區(qū)奶牛乳房炎引起的病原主要是葡萄球菌,但也出現了左氏無綠藻的感染。作為主要病原菌的葡萄球菌的耐藥模式上可以看出,利用針對干擾核酸代謝的藥物和針對影響蛋白合成的抗生素的合用或者氟苯尼考在控制葡萄球菌的感染上可能有較好的效果。而對耐藥基因失效的原因,推斷是細菌在繁殖過程中部分耐藥基因出現了變異,這為細菌進一步耐藥創(chuàng)造了條件,同時也產生某些不利于耐藥的突變,導致耐藥性減弱或消失。
【關鍵詞】：奶牛乳房炎 葡萄球菌 耐藥模式
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符號說明10-11
• 文獻綜述11-22
• 1. 奶牛乳房炎概述11
• 2. 乳房炎病因11-13
• 2.1 病原微生物11-13
• 2.2 環(huán)境因素13
• 2.3 遺傳因素13
• 2.4 營養(yǎng)因素13
• 2.5 管理因素13
• 3. 乳房炎治療方法13-16
• 3.1 抗生素療法14
• 3.2 中草藥療法14-15
• 3.3 生物療法15
• 3.4 微生態(tài)制劑療法15-16
• 3.5 細胞因子療法16
• 4. 乳房炎源性葡萄球菌的抗生素耐藥性16-21
• 4.1 葡萄球菌對內酰胺類藥物的耐藥性16-17
• 4.2 葡萄球菌對氨基糖甙類藥物的耐藥性17
• 4.3 葡萄球菌對大環(huán)內酯類、林可霉素類、鏈陽霉素類藥物的耐藥性17-18
• 4.4 葡萄球菌對四環(huán)素素類藥物的耐藥性18-19
• 4.5 葡萄球菌對喹諾酮類藥物的耐藥性19
• 4.6 葡萄球菌對磺胺類藥物的耐藥性19
• 4.7 葡萄球菌對酰胺醇類抗生素的耐藥性19-21
• 5. 本研究的目的和意義21-22
• 研究內容一 江蘇地區(qū)奶牛乳房炎的流行病原調查以及葡萄球菌的分離純化22-28
• 1. 材料與方法22-24
• 1.1 試劑及培養(yǎng)基22
• 1.2 主要儀器22
• 1.3 奶樣采集22-23
• 1.4 細菌的分離與純培養(yǎng)23
• 1.5 生化鑒定23
• 1.6 選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)23
• 1.7 PCR鑒定左氏無綠藻23
• 1.8 左氏無綠藻藥物敏感性檢驗23-24
• 2. 結果24-26
• 2.1 細菌革蘭氏染色結果24
• 2.2 細菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)結果24-25
• 2.3 PCR鑒定左氏無綠藻和相關藥敏結果結果25-26
• 2.4 細菌分離純化結果26
• 3. 討論26-28
• 3.1 乳房炎病原菌流行情況26
• 3.2 左氏無綠藻26-28
• 研究內容二 江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌耐藥模式的探究28-37
• 1. 材料方法28-31
• 1.1 菌株28
• 1.2 主要儀器28
• 1.3 主要試劑與耗材28-29
• 1.4 細菌DNA模板制作29
• 1.5 耐藥基因檢測29-30
• 1.6 耐藥基因的克隆及鑒定30
• 1.7 藥敏試驗30
• 1.8 數據分析30-31
• 2. 結果31-33
• 2.1 藥敏結果31-32
• 2.2 多重耐藥結果32
• 2.3 耐藥基因檢測結果及其與耐藥表型的相互關系32-33
• 3. 討論33-37
• 3.1 本研究中的葡萄球菌耐藥表型的分析33-34
• 3.2 葡萄球菌耐藥基因及其耐藥模式的分析34-37
• 研究內容三 江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌部分耐藥基因失效原因的探究37-44
• 1. 材料方法37-39
• 1.1 菌株37
• 1.2 主要儀器37
• 1.3 主要試劑與耗材37-38
• 1.4 引物的設計和目的片段的擴增38
• 1.5 耐藥基因的克隆及鑒定38
• 1.6 序列測定結果的比較38
• 1.7 目的片段與原核表達載體的構建38-39
• 1.8 藥敏試驗39
• 2. 結果39-43
• 2.1 耐藥基因BLAZ、ALL-TETK和ALL-TETL擴增和轉化后酶切鑒定結果39-41
• 2.2 耐藥基因BLAZ、ALL-TETK和ALL-TETL測序結果41-42
• 2.3 耐藥基因ALL-TETK和ALL-TETL克隆株對四環(huán)素敏感性結果42-43
• 3. 討論43-44
• 3.1 本研究中BLAZ基因不耐藥的可能原因分析43
• 3.2 本研究中ALL-TETK和ALL-TETL基因不耐藥的可能原因分析43-44
• 全文小結44-45
• 參考文獻45-51
• 致謝51-52
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄52-53

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

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  本文關鍵詞：江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定與耐藥模式分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：488879