本文關(guān)鍵詞：江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定與耐藥模式分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛最常發(fā)生的疾病之一,它對牛場造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),對公共健康而言也是潛在的危機(jī)。病原菌感染是奶牛乳房炎最主要的病因。本研究采用傳統(tǒng)方法從乳房炎奶樣中進(jìn)行病原菌分離、純化,并從分離菌株藥物敏感性和耐藥基因兩方面用生物統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行分析,總結(jié)主要分離菌——葡萄球菌的耐藥模式,而后進(jìn)一步對其中部分耐藥基因失效的原因進(jìn)行探究。主要內(nèi)容如下：一、江蘇地區(qū)奶牛乳房炎的流行病原調(diào)查以及葡萄球菌的分離純化本研究在江蘇地區(qū)采集了2012年3月至2014年3月的CMT檢測陽性的630份奶樣,其中有544個奶樣檢出細(xì)菌,利用傳統(tǒng)的分離方法分離出825株,其中葡萄球菌393株,其檢出率為47.63%；鏈球菌237株,其檢出率為28.73%；桿菌190株,其檢出率為23.03%；另有5株左氏無綠藻,其檢出率為0.6%,進(jìn)行藥敏試驗結(jié)果顯示只有慶大霉素對左氏無綠藻有較好的抑制效果。二、乳房炎葡萄球菌的耐藥模式探究針對其中主要的分離菌葡萄球菌,根據(jù)其表型耐藥能力和耐藥基因上分析耐藥模式。根據(jù)CLSI的建議,使用紙片擴(kuò)散法檢測了其對15種不同抗生素的表型耐藥能力,并用PCR檢測了其中tetK、tetM、tetL、tetO、ermC、blaZ的分離率。本試驗中84.73%的葡萄球菌對青霉素耐藥,為耐藥性最強(qiáng)的抗菌藥物,其余依次為頭孢他啶(47.58%)、諾氟沙星(36.13%)；而敏感性最好的抗菌藥物是氯霉素(86.2%),其他依次是呋喃妥因(84.98%)、克拉霉素(79.39%)。在多重耐藥上看,CNS的耐藥性較多集中在雙重抗性上,而SA在四重耐藥是最集中的。而后根據(jù)卡方分析該地區(qū)葡萄球菌總體上的表型的耐藥模式,發(fā)現(xiàn)針對干擾核酸代謝的藥物,SA的耐藥能力顯著強(qiáng)于CNS；針對影響蛋白合成的抗生素,CNS的耐藥性顯著強(qiáng)于SA。這是目前耐藥性研究中首次利用卡方檢驗從藥物原理方向上去總結(jié)其耐藥性特征。從基因利導(dǎo)的耐藥模式上分析,六種耐藥基因在CNS上的檢出率都明顯高于SA,但是所有耐藥基因在SA中的有效性可達(dá)100%,CNS則不能。三分之一的CNS能對p-內(nèi)酰胺藥物耐藥的機(jī)制在于其能產(chǎn)生p-內(nèi)酰胺酶,CNS針對四環(huán)素的耐藥則主要在于tetK、tetL介導(dǎo)的蛋白泵機(jī)制,其中依賴于tetK的比重最大。但是,只有四分之一的SA針對β-內(nèi)酰胺藥物耐藥的機(jī)制在于其能產(chǎn)生p-內(nèi)酰胺酶,而其他耐藥基因擴(kuò)增率則都很低。三、葡萄球菌中部分耐藥基因失效原因的探究該研究中發(fā)現(xiàn)了其中部分菌株具有相關(guān)耐藥基因但并不能有效耐藥,菌株雖然不多,但是確實存在的。本研究主要從該類基因的堿基序列分析中著手去探究原因。將這些特殊基因和相應(yīng)有耐藥性的基因連接T載體送測序分析,結(jié)果表明,在擴(kuò)增的blaZ基因中,七個無耐藥性菌株的blaZ基因與具有耐藥性菌株的blaZ基因序列相比具有很大差異,且在GenBank中未能搜索到結(jié)果,因此判定這七個序列應(yīng)該是具有其他未知作用但目前尚未報道過的基因,同時該基因在本研究中其他葡萄球菌中并沒有擴(kuò)增得到,因此判定其在葡萄球菌中應(yīng)該為非必要的基因。同樣無耐藥性的特殊基因tetK和tetL同實際上存在的有耐藥性的tetK和tetL同源性很高,因此我們將它們都與PGEM-6P-1載體連接,檢測耐藥性。發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增的tetK基因中,取自tetK有耐藥性的陽性克隆株都對四環(huán)素表現(xiàn)耐藥,但取自四環(huán)素敏感菌株MP00109中的tetK基因轉(zhuǎn)化的克隆株依舊沒有出現(xiàn)耐藥性,說明這個tetK基因中出現(xiàn)的5個位點的突變很可能是其中的關(guān)鍵位點。而取自MP00101的tetK基因的克隆菌株則在抑菌圈內(nèi)部有部分細(xì)菌生長,說明在其中還存在抗藥的潛力,這點與MP00101中只有一個位點的突變相符,說明該位點決定的耐藥性在抗生素的壓力下存在回復(fù)突變的可能或是有其他位點的改變可以彌補(bǔ)缺失的耐藥性；在擴(kuò)增的tetL基因中,在菌株MP00213和MP00350中有效的tetL基因在克隆轉(zhuǎn)化BL21后,轉(zhuǎn)化菌對四環(huán)素只表現(xiàn)出了中介,四環(huán)素敏感菌株MP00368中的tetL克隆轉(zhuǎn)化菌對四環(huán)素依舊呈現(xiàn)了敏感,因此推測該基因在BL21菌株中依舊起到了一定影響作用。綜上所述可知,在江蘇地區(qū)奶牛乳房炎引起的病原主要是葡萄球菌,但也出現(xiàn)了左氏無綠藻的感染。作為主要病原菌的葡萄球菌的耐藥模式上可以看出,利用針對干擾核酸代謝的藥物和針對影響蛋白合成的抗生素的合用或者氟苯尼考在控制葡萄球菌的感染上可能有較好的效果。而對耐藥基因失效的原因,推斷是細(xì)菌在繁殖過程中部分耐藥基因出現(xiàn)了變異,這為細(xì)菌進(jìn)一步耐藥創(chuàng)造了條件,同時也產(chǎn)生某些不利于耐藥的突變,導(dǎo)致耐藥性減弱或消失。
【關(guān)鍵詞】：奶牛乳房炎 葡萄球菌 耐藥模式
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符號說明10-11
• 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1. 奶牛乳房炎概述11
• 2. 乳房炎病因11-13
• 2.1 病原微生物11-13
• 2.2 環(huán)境因素13
• 2.3 遺傳因素13
• 2.4 營養(yǎng)因素13
• 2.5 管理因素13
• 3. 乳房炎治療方法13-16
• 3.1 抗生素療法14
• 3.2 中草藥療法14-15
• 3.3 生物療法15
• 3.4 微生態(tài)制劑療法15-16
• 3.5 細(xì)胞因子療法16
• 4. 乳房炎源性葡萄球菌的抗生素耐藥性16-21
• 4.1 葡萄球菌對內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性16-17
• 4.2 葡萄球菌對氨基糖甙類藥物的耐藥性17
• 4.3 葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、鏈陽霉素類藥物的耐藥性17-18
• 4.4 葡萄球菌對四環(huán)素素類藥物的耐藥性18-19
• 4.5 葡萄球菌對喹諾酮類藥物的耐藥性19
• 4.6 葡萄球菌對磺胺類藥物的耐藥性19
• 4.7 葡萄球菌對酰胺醇類抗生素的耐藥性19-21
• 5. 本研究的目的和意義21-22
• 研究內(nèi)容一 江蘇地區(qū)奶牛乳房炎的流行病原調(diào)查以及葡萄球菌的分離純化22-28
• 1. 材料與方法22-24
• 1.1 試劑及培養(yǎng)基22
• 1.2 主要儀器22
• 1.3 奶樣采集22-23
• 1.4 細(xì)菌的分離與純培養(yǎng)23
• 1.5 生化鑒定23
• 1.6 選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)23
• 1.7 PCR鑒定左氏無綠藻23
• 1.8 左氏無綠藻藥物敏感性檢驗23-24
• 2. 結(jié)果24-26
• 2.1 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果24
• 2.2 細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果24-25
• 2.3 PCR鑒定左氏無綠藻和相關(guān)藥敏結(jié)果結(jié)果25-26
• 2.4 細(xì)菌分離純化結(jié)果26
• 3. 討論26-28
• 3.1 乳房炎病原菌流行情況26
• 3.2 左氏無綠藻26-28
• 研究內(nèi)容二 江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌耐藥模式的探究28-37
• 1. 材料方法28-31
• 1.1 菌株28
• 1.2 主要儀器28
• 1.3 主要試劑與耗材28-29
• 1.4 細(xì)菌DNA模板制作29
• 1.5 耐藥基因檢測29-30
• 1.6 耐藥基因的克隆及鑒定30
• 1.7 藥敏試驗30
• 1.8 數(shù)據(jù)分析30-31
• 2. 結(jié)果31-33
• 2.1 藥敏結(jié)果31-32
• 2.2 多重耐藥結(jié)果32
• 2.3 耐藥基因檢測結(jié)果及其與耐藥表型的相互關(guān)系32-33
• 3. 討論33-37
• 3.1 本研究中的葡萄球菌耐藥表型的分析33-34
• 3.2 葡萄球菌耐藥基因及其耐藥模式的分析34-37
• 研究內(nèi)容三 江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌部分耐藥基因失效原因的探究37-44
• 1. 材料方法37-39
• 1.1 菌株37
• 1.2 主要儀器37
• 1.3 主要試劑與耗材37-38
• 1.4 引物的設(shè)計和目的片段的擴(kuò)增38
• 1.5 耐藥基因的克隆及鑒定38
• 1.6 序列測定結(jié)果的比較38
• 1.7 目的片段與原核表達(dá)載體的構(gòu)建38-39
• 1.8 藥敏試驗39
• 2. 結(jié)果39-43
• 2.1 耐藥基因BLAZ、ALL-TETK和ALL-TETL擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化后酶切鑒定結(jié)果39-41
• 2.2 耐藥基因BLAZ、ALL-TETK和ALL-TETL測序結(jié)果41-42
• 2.3 耐藥基因ALL-TETK和ALL-TETL克隆株對四環(huán)素敏感性結(jié)果42-43
• 3. 討論43-44
• 3.1 本研究中BLAZ基因不耐藥的可能原因分析43
• 3.2 本研究中ALL-TETK和ALL-TETL基因不耐藥的可能原因分析43-44
• 全文小結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 致謝51-52
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄52-53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡洪華;楊永長;肖代雯;姜偉;周薇;喻華;傳良敏;劉華;黃文芳;;凝固酶陰性葡萄球菌生物被膜形成及耐藥性分析[J];中國感染控制雜志;2015年11期

2 林偉東;宰栩生;于恩琪;秦愛建;金文杰;梁祥煥;王錦榮;張軍;;江蘇地區(qū)奶牛乳房炎凝固酶陰性葡萄球菌耐藥基因分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2015年07期

3 李光輝;朱德妹;汪復(fù);倪語星;孫景勇;徐英春;張小江;胡云建;艾效曼;俞云松;林潔;孫自鏞;陳中舉;賈蓓;黃文祥;卓超;蘇丹虹;魏蓮花;吳玲;張朝霞;季萍;王傳清;王愛敏;張泓;孔菁;徐元宏;沈繼錄;單斌;杜艷;楊青;;2011年中國CHINET血培養(yǎng)臨床分離菌的分布及耐藥性[J];中國感染與化療雜志;2013年04期

4 喬昀;陳君灝;羅云桃;趙英妹;張玨;;146例金黃色葡萄球菌中紅霉素對克林霉素誘導(dǎo)耐藥分析[J];檢驗醫(yī)學(xué);2012年02期

5 王登峰;李建軍;段新華;楊學(xué)云;吳建勇;瑪利亞木;王治才;;我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀及藥敏檢測方法探討[J];中國動物傳染病學(xué)報;2011年01期

6 周永安;張景萍;金柳;張全斌;葉松華;鄭新萍;王萍;馬云霞;王鈺;唐曉溪;;金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因及5類抗生素耐藥相關(guān)基因檢測[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年11期

7 郭夢堯;王洪海;王國卿;張乃生;;奶牛乳房炎的病理機(jī)制及中藥防治研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年10期

8 富艷玲;劉愛玲;李旭東;;奶牛乳房炎防治技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國獸藥雜志;2010年07期

9 吳瓊;靳野;鄭海學(xué);劉湘濤;;氯霉素和四環(huán)素阻礙細(xì)菌蛋白分泌研究進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2010年07期

10 張杰;劉悅;李桂枝;紀(jì)傳珍;;金黃色葡萄球菌的耐藥性研究進(jìn)展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：江蘇地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定與耐藥模式分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：488879