本文關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏菌CH-1株wzxC基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)病是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一,主要侵害2-7周齡的雛鴨,發(fā)病率和死亡率可達(dá)75%。臨床上主要表現(xiàn)為困倦、下痢、共濟(jì)失調(diào),呈現(xiàn)典型的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。多糖(Polysaccharide,PS)屬于細(xì)菌的重要組成部分,其中莢膜多糖(Capsular Polysaccharide,CPS)對(duì)細(xì)菌抵抗外界環(huán)境壓力和毒力具有重要作用,但其在鴨疫里默氏菌中的合成途徑我們并不清楚。Wzx是參與CPS的合成的寡聚糖翻轉(zhuǎn)酶,同時(shí)還參與了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的合成,但兩種合成途徑有所差別。生物信息分析表明鴨疫里默氏菌B739-1128基因編碼的蛋白WzxC可能參與莢膜多糖的合成,為近一步驗(yàn)證這項(xiàng)推測(cè),我們進(jìn)行了以下研究。首先,我們利用自殺性質(zhì)粒pYA4278和同源重組技術(shù)構(gòu)建了RA-CH-1 ΔwzxC缺失株,并利用RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)突變株中wzxC下游基因B739-]129和wzxL基因,表明wzxC基因缺失不會(huì)引起B(yǎng)739-1129基因和wzxL基因的表達(dá)量發(fā)生變化。隨后,對(duì)親本株和缺失株進(jìn)行了生物學(xué)特性比較分析,包括表型特點(diǎn)、莢膜染色、生化特性、生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)wzxC基因缺失后會(huì)引起細(xì)菌的莢膜減少,生長(zhǎng)穩(wěn)定期菌量降低；故隨后對(duì)菌株進(jìn)行了耐藥性、耐干燥性、耐氧化性、血清耐受性的檢測(cè),以及對(duì)SPF雞胚的毒力和對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力檢測(cè),結(jié)果表明,wzxC基因缺失后,細(xì)菌的耐干燥性下降了、耐氧化性、耐血清殺菌能力下降明顯,對(duì)SPF雞胚的ELDso下降4.38個(gè)數(shù)量級(jí),而黏附入侵能力分別上調(diào)3.05個(gè)數(shù)量級(jí)和2.26個(gè)數(shù)量級(jí),初步表明wzxC參與了CPS的合成,且CPS對(duì)RA的黏附入侵能力中起抑制作用。最后,分別提取了RA-CH-1親本株RA-CH-1 ΔwzxC缺失株的CPS和LPS,并進(jìn)行SDS-PAGE和銀染,濃硫酸-苯酚法測(cè)定CPS提取物中多糖的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)wzxC缺失后,LPS變化不明顯,而CPS則含量降低21.23%,且其中中、長(zhǎng)鏈CPS條帶消失,表明wzxC與CPS合成相關(guān),而與LPS合成相關(guān)性不明顯�？傊�,本次實(shí)驗(yàn)從生物信息學(xué)分析的角度上和實(shí)驗(yàn)性方法上證明了鴨疫里默氏菌B739-1128編碼的WzxC蛋白參與了莢膜多糖的合成,這為研究鴨疫里默氏菌莢膜多糖和脂多糖的功能和合成途徑奠定了新的基礎(chǔ),也為研究Wzx蛋白的功能及其功能特異性積累了素材。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了RA-CH-1ΔwzxC這株毒力明顯下降但仍能保持甚至提高其黏附入侵能力的缺失株,為研究鴨疫里默氏菌減毒疫苗株提供了思路和方向。
【關(guān)鍵詞】：鴨疫里默氏菌 莢膜多糖 Wzx 毒力 耐受性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 縮略詞表10-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1.1 鴨疫里默氏菌研究進(jìn)展12-13
• 1.1.1 病原學(xué)12
• 1.1.2 血清學(xué)12
• 1.1.3 毒力因子12-13
• 1.1.4 耐藥性13
• 1.2 細(xì)菌多糖的研究進(jìn)展13-17
• 1.2.1 莢膜多糖14
• 1.2.2 脂多糖14-15
• 1.2.3 多糖合成途徑15-17
• 1.3 Wzx蛋白的研究進(jìn)展17-21
• 1.3.1 Wzx蛋白家族17
• 1.3.2 Wzx作為翻轉(zhuǎn)酶的功能確定17-18
• 1.3.3 Wzx蛋白結(jié)構(gòu)18-19
• 1.3.4 Wzx蛋白的作用機(jī)制19-20
• 1.3.5 Wzx翻轉(zhuǎn)酶的功能特異性分析20-21
• 2 研究目的與意義21-22
• 3 材料方法22-37
• 3.1 材料22-26
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒和試驗(yàn)動(dòng)物22
• 3.1.2 試劑22-23
• 3.1.3 儀器23
• 3.1.4 主要溶液的配制23-24
• 3.1.5 PCR引物設(shè)計(jì)24-25
• 3.1.6 生物信息學(xué)分析使用軟件25-26
• 3.2 試驗(yàn)方法26-37
• 3.2.1 重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建26-27
• 3.2.2 RA-CH-1 △wzxC缺失株的構(gòu)建27-28
• 3.2.3 RA-CH-1 △wzxC缺失株中B739-1129和wzxL基因的表達(dá)檢測(cè)28-30
• 3.2.4 RA-CH-1 △wzxC缺失株的表型特征研究30-31
• 3.2.5 RA-CH-1 △wzxC缺失株的耐受性分析31-33
• 3.2.6 RA-CH-1 △wzxC缺失株的毒力分析33-34
• 3.2.7 RA-CH-1 △wzxC缺失株中多糖生物學(xué)特性檢測(cè)34-37
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-57
• 4.1 生物信息學(xué)分析37-39
• 4.1.1 RA-CH-1中wzxC基因特征分析37-38
• 4.1.2 RA-CH-1中WzxC蛋白特征分析38-39
• 4.2 RA-CH-1 △WZXC缺失株的構(gòu)建39-43
• 4.2.1 重疊片段(L、S、R)的擴(kuò)增39-40
• 4.2.2 重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建40-42
• 4.2.3 RA-CH-1 △wzxC缺失株的鑒定42-43
• 4.3 RA-CH-1 △WZXC基因缺失株中B739-1129和WZXL基因的表達(dá)檢測(cè)43-47
• 4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備43-44
• 4.3.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄44-45
• 4.3.3 RA-CH-1 △wzxC基因缺失株中B739-1129的表達(dá)檢測(cè)45-46
• 4.3.4 RA-CH-1 △wzxC基因缺失株中wzxL表達(dá)檢測(cè)46-47
• 4.4 RA-CH-1 △WZXC缺失株表型研究結(jié)果47-50
• 4.4.1 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)47
• 4.4.2 表型研究47
• 4.4.3 莢膜染色47-48
• 4.4.4 生化特性48-49
• 4.4.5 對(duì)生長(zhǎng)的影響49-50
• 4.5 RA-CH-1 △WZXC缺失株的耐受性分析結(jié)果50-53
• 4.5.1 耐藥性分析50-51
• 4.5.2 耐干燥分析51
• 4.5.3 耐氧化性51-52
• 4.5.4 血清存活試驗(yàn)52-53
• 4.6 RA-CH-1 △WZXC缺失株的毒力分析結(jié)果53-54
• 4.6.1 SPF雞胚ELD_(50)53-54
• 4.6.3 細(xì)胞的黏附與入侵實(shí)驗(yàn)54
• 4.7 RA-CH-1 △WZXC缺失株中多糖生物學(xué)特性檢測(cè)54-57
• 4.7.1 凝集實(shí)驗(yàn)54-55
• 4.7.3 脂多糖的粗提取及銀染鑒定55
• 4.7.4 莢膜多糖的粗提取及銀染鑒定55-56
• 4.7.5 多糖含量的粗測(cè)定56-57
• 5 討論57-62
• 5.1 鴨疫里默氏菌B739-1128的生物學(xué)信息分析57-59
• 5.3 WZXC基因與RA-CH-1株耐受性關(guān)系59-60
• 5.4 WZXC基因是RA-CH-1重要的毒力基因60-61
• 5.5 WZXC基因參與了莢膜多糖的合成61-62
• 6 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 致謝71-72
• 文章發(fā)表情況72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 馬鵬;胡曉清;陳久洲;王小元;;大腸桿菌細(xì)胞外膜滲透性與脂多糖結(jié)構(gòu)的關(guān)系(英文)[J];微生物學(xué)通報(bào);2011年08期

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  本文關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏菌CH-1株wzxC基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：469290