由于異源抗體在寵物臨床治療中易引起宿主免疫排斥反應(yīng),因此制備基于本動(dòng)物源的基因工程抗體顯示了更大的發(fā)展優(yōu)勢(shì)和前景。為制備H3N2亞型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)的重組犬源化抗體scFv-Fc,采集CIV感染犬外周血淋巴細(xì)胞提取總RNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增IgG重鏈(VH)、輕鏈(VL)和Fc片段。利用重疊延伸PCR將VH和VL通過(guò)彈性肽鏈linker連接成單鏈抗體(scFv)片段,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取陽(yáng)性菌測(cè)序。經(jīng)分析篩選后,將目標(biāo)scFv與Fc片段鏈接,構(gòu)建scFv-Fc重組犬源抗體片段。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),獲得分子量約為50 kD的scFv和約為89 kD的重組抗體scFv-Fc�？贵w活性測(cè)定結(jié)果表明,scFv能與CIV特異性結(jié)合,1 mg/mL scFv的ELISA效價(jià)為1∶2¹⁰,血凝抑制(HI)效價(jià)為1∶2⁷,中和抗體效價(jià)為1∶20。1 mg/mL scFv-Fc的HI效價(jià)為1∶2⁶,ELISA效價(jià)1∶2⁵,中和抗體效價(jià)為1∶20。本研究成功制備了針對(duì)H3N2...

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【文章目錄】：
材料與方法
    1 毒株、質(zhì)粒及細(xì)胞系
    2 主要試劑
    3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及CIV感染
    4 外周血淋巴細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
    5 克隆及鑒定可變區(qū)基因
        5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        5.2 VH、VL及Fc基因的克隆
    6 克隆及鑒定單鏈抗體基因
        6.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        6.2 克隆單鏈抗體及Fc基因
    7 表達(dá)與鑒定單鏈抗體scfv和Fc片段
        7.1 構(gòu)建pET-32a-scFv、pET-32a-Fc和pET-32a-scFv-Fc重組表達(dá)載體
        7.2 誘導(dǎo)表達(dá)scFv、Fc和scFv-Fc蛋白
        7.3 蛋白純化及Western Blot鑒定
        7.4 血凝抑制活性檢測(cè)
        7.5 ELISA檢測(cè)
        7.6 微量中和試驗(yàn)
結(jié)果
    1克隆可變區(qū)基因與擴(kuò)增單鏈抗體基因
    2重組蛋白scFv、Fc和scFv-Fc的純化及鑒定
    3 scFv及scFv-Fc蛋白的血凝抑制效價(jià)
    4間接ELISA測(cè)定scFv及scFv-Fc的活性
    5 scFv與scFv-Fc的中和效價(jià)
討論



本文編號(hào)：3996099