2009年4月,一種新型的A型流感病毒在墨西哥和美國爆發(fā),隨后這種新出現(xiàn)的流感病毒快速的造成了21世紀第一次人類流感大流行。遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育進化分析顯示H1N1/2009病毒是由豬群中多種譜系豬流感病毒病毒重排產(chǎn)生的。然而,系統(tǒng)發(fā)育進化分析還顯示H1N1/2009分離株相對于其祖先豬流感病毒還具有一個較長的進化臂。因此,H1N1/2009病毒被認為是由一個重排的前體病毒從豬群中進化而來,但是由于缺少直接的流行病學(xué)監(jiān)測證據(jù),具有與H1N1/2009病毒相同重排模式的病毒從未被發(fā)現(xiàn)過。因而,H1N1/2009病毒的產(chǎn)生一直是一個懸而未決的科學(xué)問題。 為了模擬H1N1/2009病毒的產(chǎn)生途徑,本研究將一株之前本實驗室構(gòu)建的與H1N1/2009病毒的基因組合方式一致的重排病毒(rH1N1)在豬體內(nèi)連續(xù)傳代,然后通過深度測序和基因組測序分析rH1N1傳代病毒的遺傳變異特征,并以豬、豚鼠、雪貂等動物模型研究了rH1N1傳代病毒的致病性和傳播性。研究發(fā)現(xiàn),傳至第九代時,傳代病毒感染的豬出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,包括發(fā)熱、氣喘、咳嗽等。從第九代豬體內(nèi)采集了病毒樣本,并對其遺傳變異進行了系統(tǒng)的分析。深度測序結(jié)...

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
插圖目錄
附表目錄
符號與縮略語
主要儀器設(shè)備
第一章 文獻綜述
    1.1 A型流感病毒的進化
        1.1.1 A型流感病毒的生態(tài)學(xué)
        1.1.2 A型流感病毒的宿主限制
        1.1.3 A型流感病毒的跨宿主傳播的進化方式
        1.1.4 大流行流感病毒的重排模式
    1.2 豬是流感病毒的混合器
        1.2.1 豬在流感病毒傳播中的作用
        1.2.2 豬對人流感和禽流感病毒易感
        1.2.3 豬、人、禽流感病毒在豬體內(nèi)的重排
        1.2.4 豬傳播流感病毒至人類
    1.3 H1N1/2009大流行流感病毒的產(chǎn)生和流行
        1.3.1 H1N1/2009病毒的流行情況
        1.3.2 H1N1/2009病毒的發(fā)病機制
        1.3.3 H1N1/2009病毒的起源
        1.3.4 H1N1/2009病毒的特性
        1.3.5 H1N1/2009病毒的流行動向
    1.4 H1N1/2009病毒分子研究進展
        1.4.1 表面蛋白
        1.4.2 聚合酶蛋白
        1.4.3 非結(jié)構(gòu)蛋白和基質(zhì)蛋白
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 H1N1/2009“前體”病毒在豬體中傳代
    摘要
    2.1 材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 購買材料及試劑
        2.1.3 配制試劑
        2.1.4 試驗動物
        2.1.5 細胞
    2.2 方法
        2.2.1 病毒的豬體傳代試驗
        2.2.2 病毒樣本半數(shù)組織感染量(TCID₅₀)的測定
        2.2.3 病理切片制作
        2.2.4 肺總體和微觀病變打分
        2.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 傳代病毒感染的豬臨床癥狀觀察
        2.3.2 傳代病毒感染的豬肺組織病理學(xué)變化
        2.3.3 傳代病毒感染的豬體內(nèi)病毒的復(fù)制
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 第九代病毒樣本的遺傳變異分析及代表性克隆株的篩選
    摘要
    3.1 材料
        3.1.1 病毒
        3.1.2 購買材料及試劑
        3.1.3 配制試劑
        3.1.4 細胞
    3.2 方法
        3.2.1 病毒RNA提取
        3.2.2 病毒基因組分段RT-PCR擴增
        3.2.3 深度測序
        3.2.4 噬斑純化
        3.2.5 病毒單克隆基因組測序(Sanger測序)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 第九代豬鼻洗液和BALF中病毒RNA基因組擴增
        3.3.2 第九代病毒準種深度測序分析
        3.3.3 上、下呼吸道中代表性病毒克隆株的篩選
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 第九代病毒克隆株的體外活性測定
    摘要
    4.1 材料
        4.1.1 病毒
        4.1.2 購買材料及試劑
        4.1.3 儀器
        4.1.4 配制試劑
        4.1.5 細胞
    4.2 方法
        4.2.1 體外生長曲線測定
        4.2.2 Western blot檢測NP蛋白表達
        4.2.3 聚合酶活性測定
        4.2.4 劑量依賴性ELISA法測定病毒受體結(jié)合性
        4.2.5 NA酶活性測定
        4.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 第九代病毒克隆株體外復(fù)制力測定
        4.3.2 第九代病毒克隆株聚合酶活性測定
        4.3.3 第九代病毒克隆株受體結(jié)合性測定
        4.3.4 第九代病毒克隆株NA酶活性測定
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 第九代病毒克隆株對豬的致病性及其接觸傳播性
    摘要
    5.1 材料
        5.1.1 病毒
        5.1.2 購買材料及試劑
        5.1.3 配制試劑
        5.1.4 試驗動物
        5.1.5 細胞
    5.2 方法
        5.2.1 試驗設(shè)計
        5.2.2 樣本病毒半數(shù)組織感染量(TCID₅₀)的測定
        5.2.3 病理切片制作
        5.2.4 肺總體和微觀病變打分
        5.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 攻毒豬和接觸豬臨床癥狀觀察
        5.3.2 攻毒豬和接觸豬肺病理變化和病毒載量測定
        5.3.3 攻毒豬和接觸豬鼻拭子分毒情況
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 第九代病毒克隆株在豚鼠間的接觸傳播性及關(guān)鍵氨基酸突變位點的鑒定
    摘要
    6.1 材料
        6.1.1 病毒
        6.1.2 購買材料及試劑
        6.1.3 配制試劑
        6.1.4 轉(zhuǎn)錄/表達載體
        6.1.5 試驗動物
        6.1.6 細胞
    6.2 方法
        6.2.1 豚鼠接觸傳播試驗
        6.2.2 病毒樣本半數(shù)組織感染量(TCID₅₀)的測定
        6.2.3 突變病毒反向遺傳操作系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.2.4 突變病毒的拯救
        6.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 第九代病毒克隆在豚鼠間的接觸傳播
        6.3.2 突變病毒的拯救
        6.3.3 突變病毒感染豚鼠的鼻拭子排毒檢測
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
第七章 第九代病毒克隆株對雪貂的致病性及其呼吸道飛沫傳播性
    摘要
    7.1 材料
        7.1.1 病毒
        7.1.2 購買材料及試劑
        7.1.3 配制試劑
        7.1.4 試驗動物
        7.1.5 細胞
    7.2 方法
        7.2.1 雪貂試驗設(shè)計
        7.2.2 病毒樣本半數(shù)組織感染量(TCID₅₀)的測定
        7.2.3 病理切片制作
        7.2.4 肺總體和微觀組織病理學(xué)評價
        7.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    7.3 結(jié)果
        7.3.1 攻毒組和呼吸道飛沫傳播組雪貂的臨床癥狀觀察
        7.3.2 攻毒組和呼吸道飛沫傳播組雪貂的肺病理變化
        7.3.3 攻毒組和呼吸道飛沫傳播組雪貂鼻拭子的分毒情況
    7.4 討論
    7.5 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3979769