為獲得穩(wěn)定表達(dá)豬源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的細(xì)胞株,用以增殖豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬源ACE2的豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2),并對(duì)PEDV在該細(xì)胞上的增殖進(jìn)行了分析。將重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV3-porcine-ACE2-GFP轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞后,經(jīng)潮霉素B篩選和單克隆細(xì)胞培養(yǎng),獲得IPEC-J2-ACE2細(xì)胞系。通過熒光定量RT-PCR和Western blot對(duì)單克隆細(xì)胞中ACE2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。以PEDV-WH株感染IPEC-J2-ACE2細(xì)胞,通過間接免疫熒光試驗(yàn)和熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PEDV-WH株在IPEC-J2-ACE2細(xì)胞中比在IPEC-J2細(xì)胞中的增殖能力高。

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圖2重組質(zhì)粒pCMV3-porcine-ACE2-GFP的雙酶切鑒定

分別對(duì)pCMV3-porcine-ACE2-GFP質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定豬源ACE2基因，BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定GFP基因，PCR電泳結(jié)果顯示，插入的目的片段與預(yù)期大小一致（豬源ACE2基因2416bp,GFP基因714bp），送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)....

圖3IPEC-J2-ACE2細(xì)胞的篩選

分別提取IPEC-J2-ACE2細(xì)胞和IPEC-J2細(xì)胞的總RNA，然后進(jìn)行相對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，與IPEC-J2細(xì)胞組相比，IPEC-J2-ACE2細(xì)胞組豬源ACE2基因的mRNA水平明顯升高（圖4）。將IPEC-J2-ACE2細(xì)胞和IPEC-J2細(xì)胞的蛋白樣....

圖4IPEC-J2-ACE2細(xì)胞中ACE2的mRNA表達(dá)

圖3IPEC-J2-ACE2細(xì)胞的篩選圖5IPEC-J2-ACE2細(xì)胞中ACE2的蛋白表達(dá)

圖5IPEC-J2-ACE2細(xì)胞中ACE2的蛋白表達(dá)

圖4IPEC-J2-ACE2細(xì)胞中ACE2的mRNA表達(dá)2.5PEDV-WH毒株在IPEC-J2-ACE2細(xì)胞中的增殖

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