腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)可以感染多種哺乳動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物和人并引發(fā)腦炎、心肌炎和心肌周?chē)椎劝Y狀；能引致母豬繁殖障礙和仔豬致死性心肌炎，致死率可達(dá)100%；而人多以亞臨床形式存在。目前EMCV流行范圍越來(lái)越廣，在亞洲、非洲、美洲、歐洲和澳洲均有發(fā)現(xiàn)，且感染率逐年增加，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的影響，同時(shí)也危害著人類(lèi)健康。 本研究以腦心肌炎病毒為對(duì)象，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究： 1.研發(fā)了EMCV雙抗原夾心ELISA試劑盒并獲得了國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)：試劑盒以EMCV重組VP1、VP2和2C蛋白作為包被抗原，HRP標(biāo)記的EMCV為酶標(biāo)抗原，最適包被濃度為6μg/mL，最適酶標(biāo)抗原濃度為1:400，最佳樣品作用時(shí)間為45min，最佳顯色時(shí)間為30min。與間接ELISA比較，符合率93.5%，特異性為95%，敏感性為92.9%，與FMD、HEV、PPV、BVDV等病毒抗血清無(wú)交叉反應(yīng)，連續(xù)生產(chǎn)3批次，批間和批內(nèi)CV%均小于6%。因此所研發(fā)的試劑盒重復(fù)性、特異性和穩(wěn)定性較好，靈敏度較高，可以作為EMCV臨床抗體檢測(cè)和血清學(xué)調(diào)查有效的方法。 ...

【文章頁(yè)數(shù)】：91 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 EMCV 分類(lèi)
    1.2 EMCV 理化特征
    1.3 EMCV 分子生物學(xué)特征
    1.4 EMCV 致病性及臨床癥狀
        1.4.1 EMCV 致病性
        1.4.2 EMCV 感染的臨床癥狀
    1.5 EMCV 流行情況
    1.6 EMCV 毒株分離及鑒定
    1.7 EMCV 診斷和檢測(cè)方法
    1.8 EMCV 的預(yù)防
    1.9 本研究意義
第二章 腦心肌炎病毒雙抗原夾心 ELISA 建立
    2.1 材料和儀器設(shè)備
        2.1.1 主要試劑和材料
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 EMCV VP2 引物
    2.2 方法和步驟
        2.2.1 EMCV VP2 重組蛋白表達(dá)和純化
        2.2.2 各組分最適濃度優(yōu)化
        2.2.3 最佳反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化
        2.2.4 組裝試劑盒，確定說(shuō)明書(shū)
        2.2.5 試劑盒質(zhì)量檢測(cè)
        2.2.6 與間接法 ELISA 比較
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 VP2 基因的 PCR 擴(kuò)增
        2.3.2 PCR 產(chǎn)物和載體雙酶切
        2.3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.5 Western-blot 分析
        2.3.6 最適包被濃度確定
        2.3.7 最適封閉液濃度確定
        2.3.8 最適酶標(biāo)抗原濃度確定
        2.3.9 樣品最佳反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化
        2.3.10 酶標(biāo)抗原最佳作用時(shí)間優(yōu)化
        2.3.11 最佳顯色時(shí)間優(yōu)化
        2.3.12 試劑盒說(shuō)明書(shū)
        2.3.13 試劑盒穩(wěn)定性
        2.3.14 試劑盒特異性
        2.3.15 試劑盒精密性
        2.3.16 與間接法 ELISA 法比較
    2.4 小結(jié)
第三章 腦心肌炎病毒血清學(xué)調(diào)查
    3.1 材料和儀器設(shè)備
        3.1.1 血清樣本
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 方法和步驟
        3.2.1 樣品處理
        3.2.2 樣品檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 全國(guó)各地區(qū)人感染 EMCV 血清學(xué)調(diào)查
        3.3.2 特定人群 EMCV 流行病學(xué)調(diào)查
        3.3.3 全國(guó)各地區(qū)豬感染 EMCV 流行病學(xué)調(diào)查
        3.3.4 固定豬群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)
    3.4 小結(jié)
第四章 腦心肌炎病毒甘肅毒株 GS01 分離鑒定
    4.1 材料和儀器設(shè)備
        4.1.1 材料
        4.1.2 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 主要儀器設(shè)備
        4.1.5 引物
    4.2 方法和步驟
        4.2.1 病料處理
        4.2.2 細(xì)胞接種
        4.2.3 RT-PCR 檢測(cè)
        4.2.4 分離病毒鑒定
        4.2.5 基因序列測(cè)定和分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 病毒的分離培養(yǎng)
        4.3.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果
        4.3.3 測(cè)序結(jié)果及分析
        4.3.4 病毒 TCID50測(cè)定
        4.3.5 瓊脂擴(kuò)散結(jié)果
        4.3.6 熒光定量 PCR 結(jié)果
        4.3.7 病毒對(duì)小鼠致病性結(jié)果
        4.3.8 基因全序測(cè)定及分析
        4.3.9 Genbank 提交
    4.4 小結(jié)
第五章 RNAI 靶向 VP1 基因抑制腦心肌炎病毒復(fù)制
    5.1 材料和儀器設(shè)備
        5.1.1 細(xì)胞及毒株
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
        5.1.4 引物
    5.2 方法和步驟
        5.2.1 siRNA 序列的設(shè)計(jì)、合成和構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒
        5.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞
        5.2.3 RNAi 抑制 EMCV 病毒復(fù)制
        5.2.4 病毒感染力測(cè)定（TCID50）
        5.2.5 熒光定量檢測(cè)病毒基因復(fù)制情況
        5.2.6 shRNA 特異性驗(yàn)證
        5.2.7 shRNA 對(duì)真核表達(dá)載體 pEGFP-VP1 表達(dá)抑制情況
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞情況
        5.3.2 RNAi 抑制病毒復(fù)制效果觀察
        5.3.3 病毒感染力測(cè)定（TCID50）測(cè)定結(jié)果
        5.3.4 熒光定量檢測(cè)分析
        5.3.5 X109-2 組對(duì)乙型腦炎病毒、口蹄疫病毒復(fù)制作用
        5.3.6 對(duì) X109-2 和 pEGFP–C1-VP1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn) CHO-K1
    5.4 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3978880