副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)和豬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是引起豬發(fā)生呼吸道綜合征(PRDC)的重要致病因子。機體在各種應激因素的影響下或感染導致免疫力下降的病毒性疾病時,均易導致Hps和Bb的感染率大大增加。這兩種病原菌混合感染情況十分普遍,且都易引起豬呼吸道隱性感染及急、慢性炎癥,臨床癥狀相似不易區(qū)分,給臨床診斷和防治帶來困難。本研究依據Hps OMP P2基因和Bb DNT基因成功建立了一種快速、簡便、精準和靈敏的可同時檢測具有毒力的副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌的診斷方法。通過試驗證實,建立的雙重PCR法特異性強,敏感性高,重復性好,并成功應用于臨床實踐。1.雙重PCR方法的建立依據Hps OMP P2和Bb DNT基因序列各設計1對引物,并對引物進行二聚體、同源性、互補性分析,試驗預計分別能擴增出748 bp和344 bp的DNA片段。利用設計的引物分別對Hps OMP P2基因和Bb DNT基因進行PCR擴增,并在單一PCR基礎上進一步優(yōu)化雙重PCR的反應條件,包括引物濃度、退火溫度...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
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第一章 文獻綜述
    1 副豬嗜血桿菌
        1.1 副豬嗜血桿菌病概述
        1.2 副豬嗜血桿菌的特性
            1.2.1 病原特性
            1.2.2 培養(yǎng)特性
        1.3 副豬嗜血桿菌主要毒力因子
            1.3.1 外膜蛋白(OMP)
            1.3.2 莢膜多糖(CP)
            1.3.3 脂多糖(LPS)
            1.3.4 轉鐵蛋白
            1.3.5 菌毛
            1.3.6 酶類
        1.4 副豬嗜血桿菌病的發(fā)病機理
        1.5 副豬嗜血桿菌病的流行病學
        1.6 臨床癥狀及病理變化
        1.7 副豬嗜血桿菌診斷方法
            1.7.1 細菌分離
            1.7.2 血清學診斷方法
            1.7.3 PCR方法
        1.8 副豬嗜血桿菌病的治療與防制
            1.8.1 藥物防治
            1.8.2 疫苗
    2 支氣管敗血波氏桿菌病
        2.1 支氣管敗血波氏桿菌病概述
        2.2 支氣管敗血波氏桿菌的特性
            2.2.1 病原特性
            2.2.2 培養(yǎng)特性
        2.3 支氣管敗血波氏桿菌主要毒力因子
            2.3.1 絲狀血凝素(FHA)
            2.3.2 百日咳桿菌粘附素(PRN)
            2.3.3 菌毛(fimbriae)
            2.3.4 腺苷環(huán)化酶溶血素(AC-Hly)
            2.3.5 皮膚壞死毒素(DNT)
            2.3.6 Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type-Ⅲ secretion system)
        2.4 支氣管敗血波氏桿菌病的發(fā)病機理
        2.5 支氣管敗血波氏桿菌病的流行特征
        2.6 臨床癥狀及病理變化
        2.7 支氣管敗血波氏桿菌診斷方法
            2.7.1 傳統(tǒng)診斷方法
            2.7.2 分子生物學診斷
        2.8 支氣管敗血波氏桿菌病的治療與防制
            2.8.1 藥物防治
            2.8.2 疫苗預防
            2.8.3 飼養(yǎng)管理
    3 本研究的目的意義及主要內容
第二章 副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌雙重PCR檢測方法的建立
    1 材料與方法
        1.1 菌株及病料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 引物的設計與合成
        1.5 模板的制備
    2 單一檢測Hps和Bb的PCR方法的建立
        2.1 單一PCR擴增及Hps各血清型檢測
        2.2 PCR產物檢測
        2.3 單一PCR各參數(shù)的優(yōu)化
        2.4 單一PCR的特異性檢驗
        2.5 單一PCR的敏感性檢驗
    3 雙重PCR檢測方法的建立
        3.1 雙重PCR條件的優(yōu)化
        3.2 雙重PCR方法敏感性試驗
        3.3 雙重PCR方法的特異性試驗
        3.4 雙重PCR方法的重復性試驗
        3.5 雙重PCR陽性產物測序及序列分析
        3.6 雙重PCR方法與其他檢測方法的比較
    4 結果
        4.1 單一PCR方法的建立
            4.1.1 單一PCR擴增及Hps各血清型檢測
            4.1.2 單一PCR陽性產物的克隆測序與序列分析
            4.1.3 單一PCR擴增各參數(shù)的優(yōu)化結果
            4.1.4 單一PCR特異性試驗結果
            4.1.5 單一PCR敏感性試驗結果
        4.2 雙重PCR擴增條件的優(yōu)化結果
            4.2.1 雙重PCR引物濃度的優(yōu)化
            4.2.2 雙重PCR退火溫度優(yōu)化結果
            4.2.3 雙重PCR延伸時間優(yōu)化結果
            4.2.4 雙重PCR dNTPs濃度的優(yōu)化
            4.2.5 雙重PCR rTaq DNA polymerase濃度的優(yōu)化
            4.2.6 雙重PCR MgCL2濃度的優(yōu)化
            4.2.7 雙重PCR方法的確定
            4.2.8 雙重PCR特異性試驗
            4.2.9 雙重PCR敏感性試驗
            4.2.10 雙重PCR重復性試驗
            4.2.11 雙重PCR陽性產物測序及序列分析
            4.2.12 雙重PCR方法與其他檢測方法效果比較
    5 分析討論
    6 結論
第三章 副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌雙重PCR檢測方法的應用
    1 實驗材料
        1.1 病料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 實驗方法
        2.1 病料處理及模板的制備
        2.2 Hps和Bb雙重PCR檢測
        2.3 雙重PCR方法運用于菌落與組織樣品的檢測
    3 結果
        3.1 臨床樣品中不同組織的感染情況
        3.2 臨床病料中Hps和Bb的感染情況
            3.2.1 不同地區(qū)感染情況調查
            3.2.2 不同季節(jié)感染情況調查
            3.2.3 混合感染情況調查
            3.2.4 不同日齡感染情況調查
        3.3 雙重PCR方法運用于菌落與組織樣品的檢測
    4 討論
        4.1 易感部位
        4.2 地區(qū)分布
        4.3 季節(jié)分布
        4.4 混合感染
        4.5 不同日齡感染情況
    5 結論
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3971041