【目的】本研究通過(guò)克隆禽源U6（cU6）和人源U6（hU6）啟動(dòng)子，構(gòu)建以綠色熒光蛋白EGFP作為報(bào)告基因的真核表達(dá)載體，分別比較二者在Hela細(xì)胞和DF-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步分析cU6啟動(dòng)子在禽源細(xì)胞體外表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用潛力；應(yīng)用cU6啟動(dòng)子構(gòu)建真核表達(dá)載體，建立雞朊蛋白（ChPrPC）過(guò)表達(dá)的DF-1穩(wěn)定細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討ChPrPC影響禽類(lèi)細(xì)胞分化、增殖及凋亡的分子機(jī)制提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型；參考PrPC的促細(xì)胞增殖及粘附的功能，通過(guò)分析ChPrPC過(guò)表達(dá)對(duì)DF-1細(xì)胞增殖、粘附和侵襲的影響，為進(jìn)一步闡明ChPrPC生理功能提供依據(jù)。 【方法】參考已報(bào)道的U6啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆獲得cU6和hU6核心啟動(dòng)子序列，構(gòu)建以綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因的禽源和人源U6啟動(dòng)子重組表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染Hela和DF-1細(xì)胞系，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡、熒光定量RT-PCR、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)等方法，分別檢測(cè)不同的重組載體轉(zhuǎn)染Hela和DF-1細(xì)胞12、24和36h后熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和EGFP表達(dá)水平差異；根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已克隆的雞朊蛋白基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，通...

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1-1核心啟動(dòng)子元件示意圖

生物體所具有的遺傳性狀稱(chēng)之為表型，表型是基因型與外界環(huán)境因素相互作用的。傳統(tǒng)研究認(rèn)為，除環(huán)境因素影響外，生物體表型多態(tài)性主要是由于相關(guān)基因編碼區(qū)造成的。近年研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)相近物種的蛋白質(zhì)組成基本相同，卻表現(xiàn)出明顯的生理異[1]。因此，越來(lái)越多學(xué)者認(rèn)為，物種間的差異不僅是基因水平上....

圖1-2Caudal蛋白激活DPE元件或TATA框元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄Fig.1-2CaudalactivatestranscriptionfromDPE-dependentorTATA-dependentcorepromoters.

件（Motiftenelement，MTE）是過(guò)表達(dá)基因啟動(dòng)子序列的功能性激活位于DPE元件上游，處于Inr下游+18至+27位點(diǎn)，該序列元件在NA中高度保守[27]。DNaseⅠ足跡法證實(shí)，MTE元件同DPE元件相FⅡD特異性識(shí)別的序列元件[28]。MT....

圖2-1人朊蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

（Cys）殘基之間有一個(gè)二硫鍵，能夠穩(wěn)定朊蛋白的高級(jí)構(gòu)象（圖2-1）[13]。序列分析顯示，禽類(lèi)PrP同哺乳動(dòng)物朊蛋白基因推導(dǎo)氨基酸序列序列相比，同源性?xún)H有30%。然而比較其高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二者C-端均由2個(gè)短的反向平行β折疊和3個(gè)α螺旋組成球型結(jié)構(gòu)域,且組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件長(zhǎng)度及....

圖2-2朊蛋白通過(guò)GPI錨定于細(xì)胞表面的高級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

同源性?xún)H有30%。然而比較其高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二者C-端均由2個(gè)短的反向平行β折疊和3個(gè)α螺旋組成球型結(jié)構(gòu)域,且組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件長(zhǎng)度及位置基本相同，并通過(guò)GPI受體結(jié)合位點(diǎn)附著于細(xì)胞膜上（圖2-2）[14]。哺乳動(dòng)物朊蛋白N-端的氨基酸殘基之間有一個(gè)富含組氨酸和甘氨酸的八肽重復(fù)....

本文編號(hào)：3969462