為篩選豬痘病毒(SWPV)復制非必需區(qū)并測定其缺失株的生物學特性,本研究根據(jù)同源重組原理分別針對SWPV的TK(ORF063)、ORF121和ORF143基因設計引物。應用重疊延伸PCR技術拼接同源重組左右臂及EGFP篩選標記表達盒,將拼接片段分別轉染到感染SWPV的PK15細胞。利用熒光顯微鏡觀察標記含EGFP的單個蝕斑,篩選獲取重組毒株。應用PCR及Western blotting對重組毒株進行鑒定。分別測定各毒株感染PK15細胞的蝕斑大小和皮下接種保育豬致病性。PCR結果表明,目的基因成功整合到相應位點,成功獲得重組毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting結果顯示,連續(xù)傳代的重組毒株在PK15細胞上穩(wěn)定表達外源蛋白。重組毒株在PK15細胞上形成的痘斑均小于親本毒株,其中ORF121缺失株差異極顯著(P<0.01)。各毒株均可導致保育豬痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病變時間短,產(chǎn)生痘斑小,毒力較親本下降。綜上所述,本研究篩選到2個SWPV基因組中可供外源蛋白插入的復制非必需區(qū)ORF121和ORF143,為構建SWPV...

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【部分圖文】：

圖4轉染結果(100×)

圖3SOE-PCR擴增結果圖5重組病毒純化(100×)

圖5重組病毒純化(100×)

圖4轉染結果(100×)2.4重組病毒的PCR鑒定結果

圖1rSWPV的構建示意圖

用胰蛋白酶-EDTA消化,每48h傳代PK15細胞,鋪于6孔板中,生長至90%融合度時,取SWPV-JX20G株病毒液以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基做5倍稀釋后感染6孔板中細胞。吸附4h,期間每隔30min輕晃搖勻,使病毒充分感染PK15細胞。以總量4μg目的基因轉染....

圖2片段擴增結果

以SWPV-JX20G株基因組為模板擴增同源重組左右臂片段,片段大小分別為ORF121左臂786bp、ORF121右臂843bp、ORF143左臂883bp、ORF143右臂835bp、TK左臂947bp、TK右臂1022bp,pSWE11-28C為模板擴增缺失回補....

本文編號：3966259