為篩選豬痘病毒(SWPV)復(fù)制非必需區(qū)并測定其缺失株的生物學(xué)特性,本研究根據(jù)同源重組原理分別針對SWPV的TK(ORF063)、ORF121和ORF143基因設(shè)計引物。應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)拼接同源重組左右臂及EGFP篩選標(biāo)記表達(dá)盒,將拼接片段分別轉(zhuǎn)染到感染SWPV的PK15細(xì)胞。利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記含EGFP的單個蝕斑,篩選獲取重組毒株。應(yīng)用PCR及Western blotting對重組毒株進(jìn)行鑒定。分別測定各毒株感染PK15細(xì)胞的蝕斑大小和皮下接種保育豬致病性。PCR結(jié)果表明,目的基因成功整合到相應(yīng)位點,成功獲得重組毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting結(jié)果顯示,連續(xù)傳代的重組毒株在PK15細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。重組毒株在PK15細(xì)胞上形成的痘斑均小于親本毒株,其中ORF121缺失株差異極顯著(P<0.01)。各毒株均可導(dǎo)致保育豬痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病變時間短,產(chǎn)生痘斑小,毒力較親本下降。綜上所述,本研究篩選到2個SWPV基因組中可供外源蛋白插入的復(fù)制非必需區(qū)ORF121和ORF143,為構(gòu)建SWPV...

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圖4轉(zhuǎn)染結(jié)果(100×)

圖3SOE-PCR擴(kuò)增結(jié)果圖5重組病毒純化(100×)

圖5重組病毒純化(100×)

圖4轉(zhuǎn)染結(jié)果(100×)2.4重組病毒的PCR鑒定結(jié)果

圖1rSWPV的構(gòu)建示意圖

用胰蛋白酶-EDTA消化,每48h傳代PK15細(xì)胞,鋪于6孔板中,生長至90%融合度時,取SWPV-JX20G株病毒液以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基做5倍稀釋后感染6孔板中細(xì)胞。吸附4h,期間每隔30min輕晃搖勻,使病毒充分感染PK15細(xì)胞。以總量4μg目的基因轉(zhuǎn)染....

圖2片段擴(kuò)增結(jié)果

以SWPV-JX20G株基因組為模板擴(kuò)增同源重組左右臂片段,片段大小分別為ORF121左臂786bp、ORF121右臂843bp、ORF143左臂883bp、ORF143右臂835bp、TK左臂947bp、TK右臂1022bp,pSWE11-28C為模板擴(kuò)增缺失回補(bǔ)....

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