本研究以植物來源長鏈脂肪酸為研究對象,研究蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運方式在長鏈脂肪酸跨牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運的作用。本研究首先利用RT-PCR技術(shù)對乳腺脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36編碼區(qū)進(jìn)行克隆和序列分析；通過組織塊培養(yǎng)和膠原酶II培養(yǎng)法分離奶牛乳腺上皮細(xì)胞,采用機械刮除法純化上皮細(xì)胞,并以熒光免疫技術(shù)鑒定角蛋白18和RT-PCR法鑒定酪蛋白,對上皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定；以獲得的乳腺上皮細(xì)胞為模型,通過構(gòu)建GFP融合質(zhì)粒技術(shù),研究相關(guān)脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白在乳腺上皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位；用C14標(biāo)記油酸和亞油酸,通過檢測細(xì)胞吸收的放射性,研究乳腺上皮細(xì)胞對油酸吸收的飽和性及轉(zhuǎn)運抑制劑對上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運油酸和亞油酸的影響。結(jié)果表明： 1.CD36基因cDNA的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)長1419bp,編碼472個氨基酸,編碼蛋白相對分子質(zhì)量為52.940KD,理論等電點為8.36。對其氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),中國荷斯坦奶牛與已知的哺乳動物CD36氨基酸序列同源性在82%-91%之間,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,中國荷斯坦奶牛乳腺CD36與豬CD36的親緣關(guān)系最近。 2.組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法兩種細(xì)...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-4CD36蛋白氨基酸序列的頓酸化位點預(yù)測

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文利用Protparam軟件分析可知CD36基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為52.940KD；分子式為C2422H3769N6()90682Si9;理論等電點為8.36;減性氣基酸總數(shù)(Arg+Lys)為49個，酸性氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為45個；亮氨酸(....

圖3-2膠原酶II培養(yǎng)法細(xì)胞形態(tài)變化

第三章奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定至18天左右，成纖維細(xì)胞基本刮除，上皮細(xì)胞大量增值（圖3-2-d)，長滿培養(yǎng)皿60%左右密度，即可消化傳代和保種。HHH^Ihh^^Ha.膠原酶消化1天（X100)b.膠原酶消化5天成纖維細(xì)胞（X100)C.上皮細(xì)胞純化13天（X100)d....

圖4-1pEGFP-C3質(zhì)粒Fig4-1pEGFP-C3plasmid

圖4-1pEGFP-C3質(zhì)粒Fig4-1pEGFP-C3plasmid主要儀器同第二章2.1.3

圖4-2CD36目的片段PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig4-2ThegelelectrophoresisofCD36genePCRproduct

mMTris-cl(pH8.5))。染乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞密度達(dá)到80-90%，接24孔板，孔底鋪爬片，每孔接種細(xì)胞xl05個，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁，按Lipofectamine2000Reagent轉(zhuǎn)盒說明書操作，準(zhǔn)備4管PCR管，分別加入2^iL，3^L,....

本文編號：3941553