豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PoRV)以及豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis of pig,TGEV)是國內規(guī)�；B(yǎng)豬業(yè)中引起仔豬腹瀉的最常見的病毒性病原,在實際養(yǎng)豬生產中給哺乳仔豬帶來極大的危害,以及較高的致死率。臨床上急需要一種有效地能夠同時鑒別診斷三種病毒性病原的檢測方法。本研究首次構建了可同時檢測PEDV、TGEV和PoRV的診斷基因芯片,主要研究內容包括下面三個方面：1.探針基因的克隆、鑒定與序列分析本研究設計并合成了PEDV、TGEV與PoRV的6對特異性引物,然后,采用PCR方法擴增并得到了6種特異性的探針基因片段PEDV-PM (421bp), PEDV-PS (474bp), TGEV-TN (362bp), TGEV-TS (276bp), PORV-NSP4 (270bp), PoRV-VP7 (381bp),分別克隆于PMD-19T載體,并對其進行測序鑒定,結果表明：連接與載體的DNA片段為本研究所需的目的...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮寫說明
文獻綜述
    1 豬傳染性胃腸炎診斷技術研究進展
        1.1 血清學診斷技術
        1.2 分子生物學檢測技術
    2 流行性腹瀉診斷技術的研究進展
        2.1 免疫血清學診斷方法
        2.2 分子生物學檢測技術
    3 輪狀病毒診斷技術研究進展
        3.1 經(jīng)典病原檢測技術
        3.2 免疫學檢測技術
        3.3 分子生物學檢測技術
    4 基因芯片及在疾病檢測中的應用
        4.1. 基因芯片概述
        4.2 基因芯片制備的基本流程
        4.3 基因芯片在疾病檢測中的應用
    5 研究目的及意義
第一章 TGEV、PEDV和PoRV探針的克隆與分析
    1 材料
        1.1 菌種與病毒
        1.2 載體與菌株
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器設備
    2 方法
        2.1 引物設計
        2.2 PEDV探針基因的制備
        2.3 TGEV、PoRV重組質粒菌的鑒定及探針的制備
        2.4 重組質粒的PCR鑒定
        2.5 核苷酸序列測定和同源性分析
    3 結果與分析
        3.1 PEDV的PM和PS探針基因擴增結果
        3.2 TGEV和PoRV探針基因的PCR擴增結果
        3.3 重組質粒PCR鑒定結果及基因序列分析
    4 討論
        4.1 探針基因的選擇
        4.2 引物的設計
        4.3 探針基因的PCR擴增、克隆與鑒定
        4.4 探針基因的DNA序列分析
    5 小結
第二章 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的構建
    1 材料
        1.1 探針基因重組質粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 探針及定位基因的制備
        2.2 基因芯片的制備
        2.3 靶基因的制備
        2.4 基因芯片檢測的操作程序
    3 結果與分析
        3.1 探針及定位基因的不同純化方法的選擇比較結果
        3.2 探針基因純化及濃度測定
    4 討論
        4.1 基因芯片載體的選擇
        4.2 基因芯片檢測技術的特點
        4.3 探針的制備
        4.4 靶基因的標記
        4.5 基因芯片雜交結果判定
    5 小結
第三章 PEDV-TGEV-PoRV檢測基因芯片的應用研究
    1 材料
        1.1 探針基因重組質粒
        1.2 毒株
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 方法
        2.1 靶基因的多重標記體系的建立
        2.2 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的特異性試驗
        2.3 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的靈敏性試驗
        2.4 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的重復使用試驗
        2.5 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片保存期試驗
    3 結果與分析
        3.1 探針基因多重PCR標記條件優(yōu)化結果
        3.2 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的特異性試驗
        3.3 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的敏感性試驗
        3.4 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片重復性試驗結果
        3.5 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的保存期試驗結果
    4 討論
        4.1 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的特異性
        4.2 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的敏感性
        4.3 PEDV-TGEV-PoRV診斷基因芯片的重復利用
    5 小結
第四章 結論
參考文獻
致謝
附錄一：探針基因的測序結果
附錄二：試劑的配置方法



本文編號：3941390