狂犬病是一種古老的而又持續(xù)流行至今的自然疫源性疾病。由于其發(fā)病后100%的致死率,狂犬病在全球范圍內(nèi)每年會奪走近5.5萬人的生命。中國是發(fā)病例數(shù)僅次于印度的狂犬病肆虐區(qū),正在經(jīng)歷新中國成立以來的第三次狂犬病大流行,年均約2000～3000患者因此而喪生。 作為一種負(fù)鏈RNA病毒,狂犬病毒遺傳變異很快。國際病毒分類學(xué)委員會(ICTV)于2012年將全球的狂犬病毒屬分為RABV、LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、 EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV、WCBV和HIBV共12個基因型,我國目前主要流行的為RABV狂犬病毒。 G蛋白是狂犬病毒的主要毒力決定因素。研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒弱毒株與街毒株致病性不同的主要原因之一是G蛋白的表達(dá)水平不同。 鑒于此,本研究針對2008年分離自中國安徽犬腦的一株狂犬病毒街毒株DRV-AH08進(jìn)行基因組序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析,進(jìn)一步研究該毒株與弱毒株ERA株G蛋白表達(dá)量、免疫原性和重組疫苗對小鼠的免疫效果的差異。主要研究內(nèi)容如下： 1狂犬病毒街毒株DRV-AH08的分類鑒定及全基因組序列測定 RT-nest PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,DRV-AH...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 狂犬病概述
    1.2 狂犬病流行概況
        1.2.1 世界狂犬病流行概況
        1.2.2 中國狂犬病流行概況
    1.3 狂犬病毒的研究進(jìn)展
        1.3.1 狂犬病毒的分類
        1.3.2 狂犬病毒的形態(tài)和構(gòu)成
        1.3.3 狂犬病毒的基因組結(jié)構(gòu)及各編碼蛋白的功能
    1.4 狂犬病的防治措施
    1.5 狂犬病疫苗研究現(xiàn)狀
        1.5.1 人用狂犬病疫苗
        1.5.2 獸用狂犬病疫苗
        1.5.3 發(fā)展中的狂犬病疫苗
第二章 研究的目的及意義
    2.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因組序列測定分析的研究目的及意義
    2.2 G蛋白免疫原性研究的目的及意義
第三章 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、細(xì)胞和菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 引物、工具酶及主要試劑
        3.1.4 免疫反應(yīng)試驗(yàn)所用抗原及血清
        3.1.5 培養(yǎng)基與抗生素及其配制
        3.1.6 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
        3.1.7 其它緩沖液及試劑
        3.1.8 實(shí)驗(yàn)動物
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 病毒增殖
        3.2.2 鼠腦組織總RNA提取
        3.2.3 狂犬病毒核酸RT-PCR檢測
        3.2.4 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測
        3.2.5 酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.6 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
        3.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.9 質(zhì)粒的制備與鑒定
        3.2.10 序列分析方法
        3.2.11 重組Bacmid DNA的提取
        3.2.12 重組桿狀病毒獲得
        3.2.13 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)SF9昆蟲細(xì)胞/BHK細(xì)胞
        3.2.14 蛋白濃度測定
        3.2.15 SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測目的蛋白的體外表達(dá)
        3.2.16 小鼠的免疫與攻毒保護(hù)性試驗(yàn)
        3.2.17 小鼠半數(shù)致死量(mLD 50)測定
        3.2.18 狂犬病毒CVS-11 TCID50測定
        3.2.19 FAVN檢測血清中中和抗體水平
        3.2.20 試驗(yàn)丟棄物的無害化處理
        3.2.21 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08全基因組序列測定
        4.1.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08核酸鑒定分析
        4.1.2 狂犬病毒街毒株全基因組序列測定
    4.2 狂犬病毒街毒株DRV-AH08全基因組序列分析
        4.2.1 分析所用序列
        4.2.2 DRV-AH08全基因組組成及分析
        4.2.3 狂犬病毒野毒株DRV-AH08系統(tǒng)進(jìn)化分析
        4.2.4 clade Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ狂犬病毒進(jìn)化分析
        4.2.5 中國流行亞類China Ⅰ和墨西哥流行株DRV-Mexico比較分析
    4.3 討論
        4.3.1 關(guān)于狂犬病毒屬分類
        4.3.2 關(guān)于DRV-AH08全基因組序列測定
        4.3.3 關(guān)于DRV-AH08全基因組結(jié)構(gòu)分析
        4.3.4 關(guān)于DRV-AH08全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析
    4.4 小結(jié)
    4.5 不同毒力毒株G蛋白免疫原性研究
        4.5.1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-X的構(gòu)建
        4.5.2 穿梭質(zhì)粒Bacmid-X的構(gòu)建
        4.5.3 重組桿狀病毒BAC-X的制備
        4.5.4 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Sf9昆蟲細(xì)胞
        4.5.5 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK細(xì)胞
        4.5.6 各重組桿狀病毒囊膜上G蛋白攜帶量研究
        4.5.7 等量重組桿狀病毒免疫小鼠實(shí)驗(yàn)
        4.5.8 等量G蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)
        4.5.9 重組桿狀病毒免疫小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
        4.5.10 討論
        4.5.11 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號：3930337