奶牛乳腺上皮細胞是唯一的乳腺分泌型細胞,其數(shù)量和活力決定了乳的產(chǎn)量和品質(zhì)。體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞組成單一,脫離了在體復雜環(huán)境的干擾,是研究乳腺發(fā)育和泌乳機制、乳腺生物反應器的有效細胞模型。目前,還沒有國際公認的永生化奶牛乳腺上皮細胞系,因此,建立穩(wěn)定有效的奶牛乳腺上皮細胞系這項研究工作一直在延續(xù)。本研究中,奶牛乳腺上皮細胞的永生化及鑒定工作分為4部分： 1.原代奶牛乳腺上皮細胞的永生化。在以往的研究中,作者已建立一套原代奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系。在本研究中,以此原代細胞培養(yǎng)體系為基礎(chǔ),采用攜帶SV40大T抗原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代奶牛乳腺上皮細胞,獲得4株永生化的奶牛乳腺上皮細胞系。經(jīng)過傳代培養(yǎng),最終得到一株傳代超過50代的永生化奶牛乳腺上皮細胞系,命名為CMEC-H; 2.永生化細胞的生物學鑒定。對永生化的奶牛乳腺上皮細胞系CMEC-H進行端粒酶活性檢測,20代的CMEC-H的端粒酶活性水平與293細胞水平一致,說明SV40大T抗原基因的插入使原代奶牛乳腺上皮細胞成功永生化；永生化的CMEC-H保持了原代細胞的形態(tài)特征,呈鵝卵石樣；細胞增殖速率加快,細胞倍增時間約為36h,...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)及其應用研究進展
    1.1 奶牛乳腺上皮細胞是重要的乳腺分泌型細胞
        1.1.1 奶牛乳腺上皮細胞是重要的乳腺分泌細胞
        1.1.2 奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)
    1.2 乳腺干細胞
    1.3 細胞永生化
        1.3.1 細胞永生化及端粒酶
        1.3.2 SV40-large T antigene
        1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒
    1.4 永生化奶牛乳腺上皮細胞系的應用及展望
        1.4.1 奶牛乳腺上皮細胞模型在乳蛋白合成機制研究領(lǐng)域的應用
        1.4.2 永生化奶牛乳腺上皮細胞模型應用展望
第二章 永生化奶牛乳腺上皮細胞系的建立
    2.1 材料和方法
        2.1.1. 主要試劑和耗材
    2.2. 方法
        2.2.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.2 原代細胞的培養(yǎng)
        2.2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝
        2.2.4 病毒感染效率的檢測
        2.2.5 乳腺上皮細胞的感染
        2.2.6 單克隆細胞株的獲得及持續(xù)培養(yǎng)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.3.2 原代細胞的準備
        2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒制備及病毒滴度檢測
        2.3.4 乳腺上皮細胞的感染及單克隆細胞株的獲得
        2.3.5 永生化細胞的傳代和培養(yǎng)
    2.4 討論
    2.5 結(jié)論
第三章 永生化奶牛乳腺上皮細胞系的生物學鑒定
    3.1 材料和方法
        3.1.1. 主要試劑和耗材
        3.1.2. 方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 永生化細胞的生物學形態(tài)
        3.2.2 端粒酶表達在永生化細胞中的表達
        3.2.3 永生化細胞生長特性
        3.2.4 永生化細胞的核型分析
        3.2.5 永生化細胞裸鼠致瘤檢測
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 永生化奶牛乳腺上皮細胞系的特征性蛋白表達
    4.1 材料和方法
        4.1.1. 主要試劑和耗材
        4.1.2.方法
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 上皮細胞特征性蛋白檢測
        4.2.2 纖維細胞特征性蛋白檢測
        4.2.3 干細胞特征性蛋白檢測
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 永生化奶牛乳腺上皮細胞系的誘導分化
    5.1 材料和方法
        5.1.1. 主要試劑和耗材
        5.1.2. 方法
        5.1.3. 數(shù)據(jù)分析
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 乳蛋白基因及合成調(diào)控基因的表達
        5.2.2 乳蛋白合成檢測
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
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本文編號：3925254