醫(yī)學研究表明CXCR1和CXCR2(CXCR1/2)及其配體CXCL8在多種疾病中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。為分析豬CXCR1/2在肺炎中的表達,研發(fā)新型獸用抗炎藥,本研究表達了豬CXCR1/2蛋白,制備了多克隆抗體,通過熒光定量PCR(q PCR)和免疫組織化學技術(IHC)分析了豬CXCR1/2在間質性肺炎、支氣管肺炎、化膿性肺炎、纖維素性肺炎和漿液性肺炎中的表達情況,并在此基礎上表達了豬CXCR1/2拮抗蛋白CXCL8(3-72)N11R/G31P(p N11R)和CXCL8(3-72)G31P(p G31P),通過細胞趨化實驗和動物實驗評價了它們的抑炎效果,擬為研發(fā)新型獸用抗炎藥提供科學依據(jù),主要研究內容如下:1樣品收集2017年3月至2018年12月共收集豬肺炎樣品136例,包含間質性肺炎81例,支氣管肺炎17例,化膿性肺炎21例,漿液性肺炎8例,纖維素性肺炎9例。2豬不同類型肺炎中CXCR1/CXCR2 m RNA的表達分析通過q PCR方法檢測不同肺炎組織中CXCR1和CXCR2的表達量。結果顯示:與正常肺組織相比,5種類型肺炎樣本中肺組織CXCR1/2 m RNA的表達量均極...

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞(Abbreviation)
1 文獻綜述
    1.1 CXCL8 的基因結構、表達與調節(jié)
    1.2 CXCR1/2 的基因結構、表達與調節(jié)
    1.3 CXCR1/2與CXCL8 的作用機理
    1.4 CXCR1/2與CXCL8 在疾病中的調節(jié)作用
    1.5 CXCR1/2 拮抗劑研究進展
    1.6 豬CXCR1/2與CXCL8 研究進展
    1.7 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 樣品收集
        2.1.2 質粒與菌株
        2.1.3 實驗動物
        2.1.4 主要儀器設備
        2.1.5 主要試劑
        2.1.6 主要試劑配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 肺炎的病理學診斷及分類
        2.2.2 豬CXCR1/2 mRNA在不同類型肺炎樣本中的表達分析
            2.2.2.1 引物設計
            2.2.2.2 豬肺組織總RNA提取
            2.2.2.3 cDNA的合成
            2.2.2.4 qPCR檢測CXCR1/2 mRNA的表達
        2.2.3 豬CXCR1/2 重組質粒的構建
            2.2.3.1 豬CXCR1/2 基因的擴增
            2.2.3.2 PCR產物的回收
            2.2.3.3 目的片段與質粒的酶切、連接與轉化
            2.2.3.4 陽性質粒的篩選
        2.2.4 豬CXCR1/2 重組蛋白的表達、純化與鑒定
            2.2.4.1 重組蛋白的預表達
            2.2.4.2 重組蛋白的大量表達與純化
            2.2.4.3 BCA法測定蛋白濃度
            2.2.4.4 重組蛋白的Western-blot鑒定
        2.2.5 鼠抗豬CXCR1/2 多克隆抗體的制備
            2.2.5.1 小鼠免疫
            2.2.5.2 多克隆抗體的純化
            2.2.5.3 多克隆抗體間接ELISA檢測
            2.2.5.4 多克隆抗體Western-blot檢測
        2.2.6 CXCR1/2 在不同類型肺炎組織中的表達與分布
            2.2.6.1 免疫組織化學染色
            2.2.6.2 IHC陽性率分析
        2.2.7 豬CXCR1/2 拮抗蛋白重組質粒的構建
            2.2.7.1 基因擴增
            2.2.7.2 PCR產物的回收
            2.2.7.3 目的片段與質粒的酶切、連接與轉化
            2.2.7.4 陽性質粒的篩選
        2.2.8 豬CXCR1/2 拮抗蛋白的表達、純化與驗證
            2.2.8.1 重組蛋白的預表達
            2.2.8.2 重組蛋白的大量表達與純化
            2.2.8.3 重組蛋白的Western-blot鑒定
        2.2.9 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對中性粒細胞遷移的影響
            2.2.9.1 豬外周血中性粒細胞的分離
            2.2.9.2 中性粒細胞活性鑒定
            2.2.9.3 中性粒細胞純度的鑒定
            2.2.9.4 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對中性粒細胞遷移的影響
        2.2.10 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對LPS誘導的小鼠肺炎的治療作用
            2.2.10.1動物實驗
            2.2.10.2 肺組織病理學觀察
            2.2.10.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細胞計數(shù)
            2.2.10.4 肺組織MPO檢測
            2.2.10.5 炎癥因子檢測
3 試驗結果
    3.1 樣品收集
    3.2 豬CXCR1/2 mRNA在不同類型肺炎樣品中的表達分析
    3.3 豬CXCR1/2 重組蛋白的表達與多克隆抗體的制備
        3.3.1 PCXCR1/2 重組質粒的構建
        3.3.2 豬CXCR1/2 重組蛋白的表達與純化
        3.3.3 鼠抗豬CXCR1/2 多克隆抗體的制備
            3.3.3.1 多克隆抗體間接ELISA檢測
            3.3.3.2 多克隆抗體Western-blot驗證
    3.4 豬CXCR1/2 在肺炎組織中的表達與分布
    3.5 豬CXCR1/2 拮抗蛋白的制備
        3.5.1 重組質粒的構建
        3.5.2 豬CXCR1/2 拮抗蛋白的表達與純化
    3.6 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對中性粒細胞遷移的影響
        3.6.1 中性粒細胞活性和純度鑒定
        3.6.2 CXCR1/2 拮抗蛋白對中性細胞定向遷移的影響
    3.7 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對LPS誘導的小鼠肺炎的治療作用
        3.7.1 肺組織病理學觀察
        3.7.2 BALF中性粒細胞計數(shù)
        3.7.3 肺組織MPO檢測
        3.7.4 肺組織炎癥因子檢測
4 討論
    4.1 豬肺炎的流行特點
    4.2 豬CXCR1/2 蛋白的原核表達
    4.3 豬CXCR1/2 在肺炎組織中的表達與分布
    4.4 豬CXCR1/2 拮抗蛋白的表達
    4.5 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對中性粒細胞趨化的影響
    4.6 豬CXCR1/2 拮抗蛋白對LPS誘導的小鼠肺炎的治療作用
5 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3915027