斯鈣素1(Stanniocalcin1, STC-1)是一種最初在硬骨魚類發(fā)現(xiàn)的低鈣性激素,在魚類它是由緊鄰腎臟而且在整個(gè)腎臟中均有分布的特殊器官—斯坦尼氏小體所分泌,該激素主要通過調(diào)節(jié)腮、小腸和腎臟Ca2+和無(wú)機(jī)磷酸鹽(Inorganic phosphate, Pi)的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)發(fā)揮其抗高鈣效應(yīng)。哺乳動(dòng)物體內(nèi),STC-1在多種器官中均有表達(dá),包括Ca2+吸收上皮如小腸、回腸、腎臟、胎盤以及其它血管化組織。哺乳動(dòng)物STC-1是一多功能效應(yīng)蛋白,如它能調(diào)節(jié)腎臟和腸道Ca2+/Pi吸收,小鼠中其超表達(dá)可致高血Pi、侏儒癥、代謝率增加等效應(yīng),近來(lái)發(fā)現(xiàn)它和癌癥也有一定的聯(lián)系。STC-1的表達(dá)受1,25(OH)2D3等理化因素調(diào)節(jié)。然而,STC-1在哺乳動(dòng)物中的多種生理作用還未完全清楚,還有待進(jìn)一步研究。 1.原核表達(dá)牛源STC-1重組蛋白 本試驗(yàn)以奶牛腎臟組織提取的總RNA合成cDNA,然后使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出除信號(hào)肽序列外的奶牛STC-1全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因。利用T-A克隆原理將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),然后將菌液進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明該...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
單位
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 斯鈣素1研究進(jìn)展
        1.1 STC發(fā)現(xiàn)歷程
        1.2 魚類STC
            1.2.1 基因表達(dá)調(diào)節(jié)
            1.2.2 STC靶器官和作用機(jī)制
        1.3 STC家族
            1.3.1 哺乳動(dòng)物STC-1的發(fā)現(xiàn)
            1.3.2 哺乳動(dòng)物STC-1表達(dá)和分布
        1.4 哺乳動(dòng)物STC-1生理功能
            1.4.1 轉(zhuǎn)基因和基因敲除研究
            1.4.2 Ca²⁺/Pi穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)
            1.4.3 對(duì)動(dòng)物發(fā)育和亞細(xì)胞功能的作用
        1.5 斯鈣素和癌癥
            1.5.1 斯鈣素和癌癥的關(guān)系
            1.5.2 STC-1在血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡中的作用
            1.5.3 STC-1和腫瘤微環(huán)境
        1.6 總結(jié)
    第二章 鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)概述
        2.1 機(jī)體Ca²⁺代謝
        2.2 機(jī)體Ca²⁺調(diào)節(jié)
        2.3 機(jī)體Ca²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)概述
            2.3.1 細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)途徑
            2.3.2 跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)
    第三章 新型鈣離子通道研究進(jìn)展
        3.1 TRPV5和TRPV6
            3.1.1 上皮細(xì)胞TRPV5和TRPV6分布
            3.1.2 TRPV5和TRPV6的分子特征
        3.2 Calbindin-D_28K和Calbindin-D9K

        3.3 NCX和PMCA
第二部分 試驗(yàn)研究
    第四章 原核表達(dá)牛源斯鈣素1重組蛋白研究
        摘要
        Abstract
        4.1 研究背景
        4.2 材料和方法
            4.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            4.2.2 試驗(yàn)材料和試劑
            4.2.3 克隆奶牛斯鈣素1基因
            4.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的TA克隆
            4.2.5 構(gòu)建STC-1原核表達(dá)載體
            4.2.6 STC-1融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 STC-1基因的擴(kuò)增和克隆
            4.3.2 RCR和酶切檢測(cè)重組質(zhì)粒pMD18-STC-1和pET-STC-1
            4.3.3 重組質(zhì)粒pET-STC-1 DNA測(cè)序
            4.3.4 SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物
        4.4 討論
    第五章 斯鈣素1蛋白在奶牛胃腸道差異性表達(dá)情況研究
        摘要
        Abstract
        5.1 研究背景
        5.2 材料與方法
            5.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            5.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            5.2.3 儀器設(shè)備
            5.2.4 半定量Real-time PCR
            5.2.5 細(xì)胞蛋白提取及蛋白含量測(cè)定
            5.2.6 免疫印跡分析
            5.2.7 數(shù)據(jù)分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 STC-1基因的擴(kuò)增曲線和融解曲線
            5.3.2 總蛋白濃度測(cè)定
            5.3.3 STC-1基因在奶牛胃腸道和腎臟的表達(dá)情況
            5.3.4 STC-1蛋白在奶牛胃腸道和腎臟的表達(dá)情況
        5.4 討論
    第六章 新生牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法建立
        摘要
        Abstract
        6.1 前言
        6.2 材料和方法
            6.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            6.2.2 主要試驗(yàn)儀器和設(shè)備
            6.2.3 無(wú)菌操作
            6.2.4 分離小腸上皮細(xì)胞
            6.2.5 純化小腸上皮細(xì)胞
            6.2.6 小腸上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            6.2.7 鑒定小腸上皮細(xì)胞
            6.2.8 PCR
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            6.3.2 電鏡和染色觀察上皮細(xì)胞
            6.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定上皮細(xì)胞
            6.3.4 PCR鑒定上皮細(xì)胞
        6.4 討論
    第七章 斯鈣素1對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的奶牛腸道上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究
        摘要
        Abstract
        7.1 研究背景
        7.2 材料和方法
            7.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
            7.2.2 主要儀器
            7.2.3 新生牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)
            7.2.4 構(gòu)建pcDNA-STC-1重組質(zhì)粒的
            7.2.5 細(xì)胞處理
            7.2.6 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色
            7.2.7 細(xì)胞存活率檢測(cè)
            7.2.8 Real-timePCR基因表達(dá)分析
            7.2.9 Westem blotting
            7.2.10 數(shù)據(jù)分析
        7.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            7.3.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中STC-1表達(dá)情況
            7.3.2 H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
            7.3.3 H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
            7.3.4 H₂O₂誘導(dǎo)的STC-1表達(dá)
            7.3.5 STC-1超表達(dá)對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的損傷的作用
            7.3.6 STC-1超表達(dá)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用
        7.4 討論
    第八章 斯鈣素1對(duì)Caco₂細(xì)胞新型鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)作用研究
        摘要
        Abstract
        8.1 研究背景
        8.2 材料和方法
            8.2.1 試驗(yàn)材料和試劑
            8.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            8.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-STC-1
            8.2.4 STC-1基因siRNA設(shè)計(jì)和合成
            8.2.5 細(xì)胞處理和重組質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染
            8.2.6 Real-time PCR
            8.2.7 Western blotting
            8.2.8 數(shù)據(jù)分析
        8.3 結(jié)果
            8.3.1 轉(zhuǎn)染后Caco2細(xì)胞中STC-1表達(dá)情況
            8.3.2 STC-1超表達(dá)對(duì)Ca²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響
            8.3.3 STC-1表達(dá)抑制對(duì)Ca²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響
        8.4 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號(hào)：3911638

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