胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎的病原菌,每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。本研究旨在利用大腸桿菌外膜囊泡(OMVs)遞呈APP GalT蛋白,并對其免疫效果進行研究,初步探索其作為新型候選疫苗的潛力。首先,成功構(gòu)建了能表達APP GalT蛋白的重組大腸桿菌。以大腸桿菌JC8031作為表達菌,pBAD18-Cm作為表達載體,先后將clyA(909bp)和galT(1050bp)基因片段連入載體中,經(jīng)終濃度為0.2%L-阿拉伯糖誘導5h后,重組大腸桿菌能夠表達由ClyA和GalT組成的融合蛋白,大小約為75KD。其次,成功建立了遞呈APP GalT蛋白的大腸桿菌OMVs制備方法。誘導20h后的重組大腸桿菌首先經(jīng)低速離心分離上清,隨后使用分子截留量為100KD的超濾管對上清液進行濃縮,再經(jīng)120,000×g超速離心3h分離沉淀后得到大腸桿菌外膜囊泡懸液。分離到的大腸桿菌外膜囊泡直徑在20-150nm之間;Western-blotting鑒定顯示重組外膜囊泡中APP GalT蛋白。最后,證明了遞呈APP Gal...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2pBAD18-ClyA-GalT重組質(zhì)粒酶切鑒定：M.DNA分子質(zhì)量標準；1.HindⅢ單酶切；

GE及質(zhì)譜檢測融合蛋白組質(zhì)粒pBAD18-ClyA-GalT的表達菌JC8031進行L-阿心收集菌體破壁處理后進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)空質(zhì)粒組，重組菌明顯存在一根過表達條帶（圖1-3）。行質(zhì)譜鑒定，經(jīng)搜庫比對后發(fā)現(xiàn)可同時比對出大腸桿菌-ClyA-GalT....

圖1-3重組質(zhì)粒表達SDS-PAGE電泳：M.蛋白分子量標準；1.未誘導的空白質(zhì)粒表達；

nblotting檢測融合蛋白表達過L-阿拉伯糖誘導表達后的重組表達菌，用PB上樣緩沖液處理后，進行SDS-PAGE電泳。以，HRP標記的羊抗小鼠IgG作為二抗，用增強型化色液，結(jié)果顯示經(jīng)誘導后的重組表達菌中有一條表達SDS-PAGE電泳：M.蛋白分子量標準....

圖1-5外膜囊泡透射電鏡拍照

組外膜囊泡的分離與鑒定射電鏡拍照離得到的外膜囊泡懸液進行透射電鏡拍照，結(jié)果顯示成功分離約為20-150nm之間，與文獻報道一致，說明異源蛋白的引入的形態(tài)發(fā)生改變（圖1-5）。組質(zhì)粒表達免疫印跡檢測：M.蛋白分子量標準；1.未誘導的表達菌菌estern-blotting....

圖1-6外膜囊泡免疫印跡檢測：M.蛋白分子量標準；1.空白囊泡；2.重組囊泡；3.陽

estern-blotting驗證囊泡加入適量的蛋白上樣緩沖液處理克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗小L）試劑作為底物顯色液，以重組表達示重組表達菌所分泌的外膜囊泡中可以呈到外膜囊泡中（圖1-6）。

本文編號：3906000