哺乳動物胚胎體外生產(chǎn)效率低,很大程度上與卵母細胞體外成熟質(zhì)量差以及卵母細胞和早期胚胎暴露于人工化學(xué)合成靜態(tài)的、不適的體外培養(yǎng)環(huán)境中造成的氧化應(yīng)激有關(guān)。哺乳動物卵母細胞和胚胎胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持是影響卵母細胞體外成熟質(zhì)量以及胚胎發(fā)育潛能的關(guān)鍵因素之一�？茖W(xué)研究表明,哺乳動物卵巢上卵泡內(nèi)壁層顆粒細胞產(chǎn)生的生理性旁分泌因子C型利鈉肽(C-type Natriuretic Peptide,CNP)具有維持卵母細胞減數(shù)分裂停滯的特性。此外,近年的研究表明,原癌基因SHC(Src homology 2 domain-containing transforming protein C,SHC)編碼的亞型66KDa線粒體氧化應(yīng)激蛋白(p66Shc)及其信號特性在調(diào)控細胞氧化應(yīng)激、細胞凋亡和機體衰老過程中發(fā)揮了重要作用。本研究旨在探討C型利鈉肽預(yù)孵育綿羊卵丘卵母細胞復(fù)合體對卵母細胞核減數(shù)分裂進程及成熟質(zhì)量的影響,采用C型利鈉肽暫時抑制綿羊卵母細胞核減數(shù)分裂進程延長胞質(zhì)成熟時間,促進核質(zhì)同步成熟,以期提高綿羊卵母細胞體外成熟質(zhì)量及其受精后胚胎的發(fā)育潛能,同時研究了氧化應(yīng)激蛋白p66Shc在綿羊卵母細胞和...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育
    1.2 卵母細胞成熟
        1.2.1 卵母細胞體內(nèi)成熟
        1.2.2 卵母細胞體外成熟
        1.2.3 卵母細胞體外成熟的探索
    1.3 C型利鈉肽概述
        1.3.1 C型利鈉肽的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能
        1.3.2 C型利鈉肽的作用機制
        1.3.3 C型利鈉肽對減數(shù)分裂的影響
    1.4 線粒體氧化應(yīng)激
        1.4.1 線粒體活性氧的產(chǎn)生
        1.4.2 線粒體氧化損傷
        1.4.3 線粒體DNA氧化損傷
        1.4.4 線粒體蛋白和脂質(zhì)氧化損傷
        1.4.5 線粒體呼吸鏈氧化損傷
    1.5 P66Shc基因的概述
        1.5.1 p66Shc基因的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能
        1.5.2 p66Shc基因?qū)�粒體氧化應(yīng)激的調(diào)控
        1.5.3 p66Shc對線粒體氧化應(yīng)激的作用機制
    1.6 本研究的目的、意義及主要研究內(nèi)容
        1.6.1 本研究的目的和意義
        1.6.2 本研究的主要內(nèi)容
2 實驗一C型利鈉肽構(gòu)建綿羊卵母細胞體外“雙階段”成熟培養(yǎng)體系
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗樣品
        2.1.2 主要試劑與藥品
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 主要工作液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 卵母細胞的采集
        2.2.2 CNP預(yù)孵育和卵母細胞體外成熟
        2.2.3 卵母細胞減數(shù)分裂進程的評估
        2.2.4 體外受精和體外培養(yǎng)
        2.2.5 總RNA提取和cDNA合成
        2.2.6 實時熒光定量PCR
        2.2.7 TUNEL分析
        2.2.8 線粒體染色
        2.2.9 統(tǒng)計分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 CNP預(yù)孵育延遲減數(shù)分裂進程的恢復(fù)
        2.3.2 NPR2的表達
        2.3.3 CNP預(yù)孵育提高了綿羊卵母細胞的發(fā)育能力
        2.3.4 囊胚的細胞凋亡
        2.3.5 線粒體分布
    2.4 討論
    2.5 結(jié)論
3 實驗二P66Shc在綿羊卵母細胞中的表達及其與胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)系
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗樣品
        3.1.2 主要試劑與藥品
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 卵母細胞的采集與體外成熟
        3.2.2 實時熒光定量PCR
        3.2.3 線粒體染色和細胞免疫熒光
        3.2.4 ROS檢測
        3.2.5 氧化還原穩(wěn)態(tài)檢測
        3.2.6 過氧化氫誘導(dǎo)處理
        3.2.7 統(tǒng)計分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 p66Shc在成熟前后不同質(zhì)量卵母細胞中的相對表達量
        3.3.2 p66Shc蛋白與線粒體在成熟前后不同質(zhì)量卵母細胞的共定位
        3.3.3 成熟前后不同質(zhì)量卵母細胞的ROS水平
        3.3.4 成熟前后不同質(zhì)量綿羊卵母細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)
        3.3.5 過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激上調(diào)p66Shc的表達
    3.4 討論
    3.5 結(jié)論
4 實驗三P66Shc在綿羊早期植入前胚胎發(fā)育過程中的表達和空間定位模式
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗樣品
        4.1.2 主要試劑與藥品
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 試驗方法
        4.2.1 卵母細胞的收集和體外成熟
        4.2.2 體外受精和體外培養(yǎng)
        4.2.3 實時熒光定量PCR
        4.2.4 免疫熒光染色和共聚焦分析
        4.2.5 統(tǒng)計分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 p66Shc在綿羊早期植入前胚胎發(fā)育過程中的表達和空間定位模式
        4.3.2 p66Shc及36位絲氨酸(Ser-36)磷酸化的p66Shc在綿羊早期植入前胚胎發(fā)育過程中的空間定位模式
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
5 實驗四p66Shc參與綿羊植入前胚胎發(fā)育過程中H₂O₂誘導(dǎo)的胞質(zhì)氧化應(yīng)激
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗樣品
        5.1.2 主要試劑與藥品
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 試驗方法
        5.2.1 卵母細胞的體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)
        5.2.2 實時定量RT-PCR
        5.2.3 氧化應(yīng)激和抗氧化處理
        5.2.4 免疫熒光染色和共聚焦分析
        5.2.5 氧化還原穩(wěn)態(tài)監(jiān)測
        5.2.6 TUNEL分析
        5.2.7 檢測ROS水平
        5.2.8 統(tǒng)計分析
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 早期植入前胚胎第一次卵裂的時間影響胚胎的發(fā)育能力和囊胚的形成
        5.3.2 早期胚胎質(zhì)量差伴隨著p66Shc表達上調(diào)和線粒體功能的下降
        5.3.3 p66Shc參與過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激
        5.3.4 H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激促使p66Shc的36位絲氨酸磷酸化
    5.4 討論
    5.5 結(jié)論
6 實驗五siRNA靶向干擾p66Shc基因?qū)d羊早期胚胎發(fā)育潛能的影響
    6.1 材料和方法
        6.1.1 實驗樣品
        6.1.2 主要試劑與藥品
        6.1.3 主要儀器設(shè)備
    6.2 試驗方法
        6.2.1 卵母細胞收集和體外成熟
        6.2.2 體外受精和體外培養(yǎng)
        6.2.3 顯微注射
        6.2.4 RT-qPCR
        6.2.5 ROS檢測
        6.2.6 p66Shc免疫熒光檢測
        6.2.7 8-OHdG檢測
        6.2.8 統(tǒng)計分析
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 評價合子階段顯微注射siRNA靶向干擾p66Shc基因的效率
        6.3.2 p66Shc基因干擾提高綿羊胚胎的發(fā)育潛能
        6.3.3 p66Shc基因干擾降低ROS的產(chǎn)生
        6.3.4 p66Shc基因干擾降低氧化應(yīng)激標(biāo)記物8-OHdG的產(chǎn)生
    6.4 討論
    6.5 結(jié)論
7 全文總體結(jié)論、創(chuàng)新點
    7.1 總體結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點
8 附錄
    8.1 附表
致謝
參考文獻
作者簡介



本文編號：3902583