為獲得山羊PHKG1基因序列,明確其生物學(xué)特征,闡明其在山羊各組織及誘導(dǎo)分化不同階段皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的表達(dá)特性,以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物,屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪等組織樣品,提取組織中總RNA,利用RT-PCR方法克隆山羊PHKG1基因序列,利用各種在線工具分析其生物學(xué)特性,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技術(shù)檢測(cè)其在各個(gè)組織及不同分化階段的前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,克隆得到的山羊PHKG1基因序列1 233 bp,其中CDS區(qū)1 164 bp,共編碼387個(gè)氨基酸,形成無(wú)信號(hào)肽的不穩(wěn)定親水酸性非跨膜蛋白,亞細(xì)胞定位顯示其主要存在細(xì)胞質(zhì)中;山羊PHKG1氨基酸序列與綿羊、牛、豬、馬、人的相似性均在90%以上,說(shuō)明該基因在不同物種中具有較高保守性;構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)顯示,山羊和綿羊在同一分支,符合物種進(jìn)化規(guī)律;組織表達(dá)譜顯示,PHKG1基因在山羊心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪中廣泛表達(dá),且在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)水平最高(P<0.01),時(shí)序表達(dá)譜顯示,PHKG1基因在成脂誘導(dǎo)分...

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圖4PHKG1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

為了研究山羊PHKG1蛋白的進(jìn)化過(guò)程,用MEGA5.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖4)顯示,山羊與綿羊首先聚為一類,親緣關(guān)系最近,因與牛同屬反芻動(dòng)物聚類在同一分支,與原雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),符合物種的進(jìn)化規(guī)律。2.4山羊PHKG1基因組織表達(dá)分析

圖5PHKG1基因在山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平

利用qPCR方法檢測(cè)PHKG1基因在山羊各個(gè)組織中的表達(dá)水平,結(jié)果表明,PHKG1基因在所檢測(cè)的7個(gè)組織中均有表達(dá),以背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)最高,極顯著高于其他的組織(P<0.01),在皮下脂肪、腎、心、肝、肺和脾組織表達(dá)量相對(duì)較低,組織間差異不顯著(圖5)。2.5山羊PHKG1基因....

圖2山羊和其他物種間PHKG1氨基酸序列比對(duì)

用ExPASy在線工具對(duì)山羊PHKG1氨基酸序列進(jìn)行分析,其預(yù)測(cè)蛋白分子式為C2016H3156N544O580S18,分子質(zhì)量為44.87ku;在氨基酸組成中,亮氨酸(Leu)含量為9.6%,是占比最高的氨基酸殘基;帶正電荷(Arg+Lys)和帶負(fù)電荷(Asp+Lys)的氨基....

圖1山羊PHKG1基因擴(kuò)增結(jié)果

以簡(jiǎn)州大耳羊背最長(zhǎng)肌cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期目的產(chǎn)物大小相符的片段(圖1),測(cè)序得到PHKG1基因片段長(zhǎng)度1233bp,其中CDS區(qū)1164bp,無(wú)5′UTR序列,3′UTR69bp,共編碼387個(gè)氨基酸。2.2山羊PHKG1基因序列分析

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