牛腸道病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員,為單股正鏈RNA病毒。病毒粒子無囊膜,為二十面體球形結(jié)構(gòu),粒子直徑約為25³0nm,基因組長度約為7500bp。2011年第9次國際病毒分類委員會(huì)分類報(bào)告將牛腸道病毒分類為EV-E和EV-F,其中EV-E分為EV-E1^E4,EV-F分為EV-F1^F6。牛腸道病毒的首次發(fā)現(xiàn)是在上世紀(jì)50年代末,由Kunin和Mc Ferran分別從健康牛糞便中分離得到,隨后世界各地陸續(xù)有該病毒的分離報(bào)道,但中國關(guān)于此病毒的流行報(bào)道較少。牛腸道病毒的病原性并不明顯,但由于其有時(shí)會(huì)侵犯其他器官而導(dǎo)致臨床上各種綜合征的出現(xiàn)。牛腸道病毒的感染宿主較廣,包括牛、羊、馬、犬、羊駝等動(dòng)物。本研究從奶牛場采集兩批糞便樣本,第一批樣本采自診斷為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陽性的患病奶牛,第二批樣本采自患有消化道疾病癥狀的奶牛,同時(shí)從該牛場采集獲得9份牛血清,血清經(jīng)BVDV抗原及抗體檢測均為陰性。兩批病料共先后分離得到10株病毒,經(jīng)BVDV巢式RT-PCR檢測均為陰性。因此,本研究對(duì)分離病毒按未知病毒進(jìn)行鑒定,核酸...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 牛腸道病毒概述
        1.1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)
        1.1.2 基因結(jié)構(gòu)及功能
        1.1.3 病毒的分類
        1.1.4 病毒的感染與復(fù)制
    1.2 牛腸道病毒的流行現(xiàn)狀
        1.2.1 國外流行現(xiàn)狀
        1.2.2 國內(nèi)流行現(xiàn)狀
        1.2.3 牛腸道病毒的檢測技術(shù)
    1.3 RNA病毒的反向遺傳學(xué)研究
        1.3.1 反向遺傳學(xué)概述
        1.3.2 RNA病毒反向遺傳學(xué)發(fā)展歷程
        1.3.3 反向遺傳學(xué)在腸道病毒中的應(yīng)用
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、病料、血清
        2.1.2 細(xì)胞、病毒、培養(yǎng)基
        2.1.3 質(zhì)粒與菌株
        2.1.4 酶類與主要試劑
        2.1.5 主要設(shè)備和儀器
        2.1.6 試劑配制
        2.1.7 試驗(yàn)參考毒株序列信息
    2.2 牛腸道病毒的分離與鑒定
        2.2.1 病料的處理
        2.2.2 病毒的分離
        2.2.3 病毒TCID50測定
        2.2.4 病毒的蝕斑純化
        2.2.5 病毒的核酸型鑒定
        2.2.6 隨機(jī)RT-PCR鑒定第一批病料
        2.2.7 RT-PCR鑒定第二批病料
        2.2.8 病毒的鑒定
    2.3 乳鼠感染模型的建立
        2.3.1 感染模型的建立
        2.3.2 多重感染模型的建立
    2.4 牛腸道病毒的全基因克隆
        2.4.1 引物設(shè)計(jì)
        2.4.2 病毒m RNA的提取
        2.4.3 5’RACE法擴(kuò)增 5’端片段
        2.4.4 其它目的片段擴(kuò)增
        2.4.5 PCR產(chǎn)物的純化與回收
        2.4.6 PCR產(chǎn)物的連接與轉(zhuǎn)化
        2.4.7 重組質(zhì)粒的鑒定及測序
        2.4.8 全基因序列的拼接和分析
    2.5 HLJ-3531株重組病毒的拯救
        2.5.1 引物設(shè)計(jì)及連接策略
        2.5.2 病毒RNA的提取
        2.5.3 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因
        2.5.4 克隆載體的構(gòu)建
        2.5.5 全長重組克隆載體p BSK-3531的構(gòu)建
        2.5.6 重組病毒的拯救
        2.5.7 重組病毒的鑒定
        2.5.8 重組病毒生物學(xué)特性的研究
3 結(jié)果與分析
    3.1 牛腸道病毒的分離鑒定
        3.1.1 病毒的分離
        3.1.2 病毒的TCID50測定
        3.1.3 病毒的蝕斑純化
        3.1.4 病毒的核酸型鑒定
        3.1.5 第一批病料PCR鑒定結(jié)果
        3.1.6 第二批病料PCR鑒定結(jié)果
        3.1.7 病毒的鑒定
    3.2 乳鼠感染模型建立
        3.2.1 感染模型建立
        3.2.2 多重感染模型的建立
    3.3 牛腸道病毒的全基因克隆
        3.3.1 5’端的克隆
        3.3.2 其他片段的擴(kuò)增與鑒定
        3.3.3 序列拼接及基因組結(jié)構(gòu)分析
        3.3.4 N-糖基化位點(diǎn)比較分析
        3.3.5 進(jìn)化樹分析
        3.3.6 VP1氨基酸比對(duì)
    3.4 HLJ-3531株感染性分子克隆的建立
        3.4.1 3531-A、3531-B片段的克隆
        3.4.2 重組克隆載體構(gòu)建結(jié)果
        3.4.3 全長重組克隆載體p BSK-3531的構(gòu)建結(jié)果
        3.4.4 重組病毒的拯救
        3.4.5 重組病毒r HLJ-3531的鑒定
        3.4.6 重組病毒r HLJ-3531的特性研究
4 討論
    4.1 牛腸道病毒的分離鑒定
    4.2 兩株病毒的宿主嗜性分析
    4.3 動(dòng)物模型的建立及組織分布
        4.3.1 感染動(dòng)物的選擇
        4.3.2 感染方式的選擇
        4.3.3 感染組織分布
        4.3.4 兩株病毒乳鼠感染模型差異的分析
    4.4 病毒的全基因序列克隆方法的分析
        4.4.1 全基因克隆策略的選擇
        4.4.2 RACE擴(kuò)增法及其影響因素
    4.5 兩株牛腸道病毒的分類分析
    4.6 HLJ-3531的感染性克隆構(gòu)建
        4.6.1 全長c DNA構(gòu)建策略
        4.6.2 重組病毒的鑒定
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3892163