目的:肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN),又稱生長分化因子8(growth differentiation factor 8,GDF-8),是TGF-β超家族成員之一。MSTN是肌細胞生長發(fā)育的負調(diào)控因子,MSTN基因變異可引起動物的“雙肌”性狀,從而提高動物的產(chǎn)肉性能。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年研究較多的基因編輯工具,其具有構(gòu)建簡單、打靶效率高、使用成本低等優(yōu)點,可在較短時間內(nèi)完成各種復(fù)雜的基因定點修飾。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),選擇綿羊MSTN基因第三外顯子作為靶位點,設(shè)計sgRNA和ssDNA,開展綿羊MSTN基因定點編輯研究,為獲得MSTN基因定向誘變的轉(zhuǎn)基因肉羊研究工作奠定基礎(chǔ)。方法:實驗一,采用Gibson Assembly方法將串聯(lián)表達原件2A和綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列插入pX330質(zhì)粒,構(gòu)建pX330-EGFP質(zhì)粒。再將12對sgRNA寡核苷酸鏈以Golden Gate方法插入pX330-EGFP質(zhì)粒,構(gòu)建pX330-EGFP-sgRNA質(zhì)粒。實驗二:利用電轉(zhuǎn)染方法...

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
第一章 文獻綜述
    第一節(jié) MSTN(MYOSTATIN)基因的研究進展
        1 MSTN的發(fā)現(xiàn)
        2 MSTN基因結(jié)構(gòu)與特征
        3 MSTN結(jié)構(gòu)與功能
        4 MSTN基因的研究意義
        5 MSTN的應(yīng)用前景
    第二節(jié) CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)
        1 CRISPR的研究歷史
        2 CRISPR/Cas系統(tǒng)分類
        3 CRISPR/Cas9的基因座結(jié)構(gòu)
        4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機制與構(gòu)建
        5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究進展
第二章 試驗研究
    試驗一 MSTN基因靶點確定及相關(guān)質(zhì)粒構(gòu)建
        1 材料與方法
            1.1 試劑與儀器
            1.2 試驗方法
                1.2.1 sgRNA及檢測引物的設(shè)計
                1.2.2 pX330-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建
                1.2.3 pX330-EGFP-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建
                1.2.4 pX330-EGFP及pX330-EGFP-SgRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
                1.2.5 pX330-EGFP-SgRNA去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
        2 結(jié)果與分析
        3 討論
        4 結(jié)論
    試驗二 高效靶向綿羊MSTN基因sgRNA的篩選
        1 材料和方法
            1.1 試劑和儀器
                1.1.1 細胞與質(zhì)粒
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 試驗方法
                1.2.1 綿羊成纖維細胞的培養(yǎng)
                1.2.2 電轉(zhuǎn)液的配制
                1.2.3 電轉(zhuǎn)染細胞
                1.2.4 SURVEYOR檢測
                1.2.5 測序鑒定
        2 結(jié)果
            2.1 pX330-EGFP-sgRNA載體轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞
            2.2 SURVEYOR分析
            2.3 測序結(jié)果
        3 討論
        4 結(jié)論
    試驗三 sgRNA及Cas9蛋白顯微注射濃度的優(yōu)化
        1 材料和方法
            1.1 試劑與儀器
            1.2 試劑的配置
            1.3 方法
                1.3.1 卵母細胞的采集
                1.3.2 卵母細胞的成熟
                1.3.3 卵母細胞的孤雌激活
                1.3.4 孤雌激活卵母細胞的顯微注射
                1.3.5 測序鑒定
        2 結(jié)果
            2.1 測序分析
        3 討論
        4 結(jié)論
    試驗四 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源指導(dǎo)修復(fù)效率的驗證
        1 材料和方法
            1.1 試劑與儀器
            1.2 方法
                1.2.1 寡核苷酸鏈(ssDNA)的設(shè)計
                1.2.2 卵母細胞的采集
                1.2.3 卵母細胞的處理與成熟
                1.2.4 卵母細胞的體外受精
                1.2.5 受精卵的顯微注射
                1.2.6 測序檢測
                1.2.7 酶切檢測
        2 結(jié)果
            2.1 優(yōu)化方案編輯效果在受精卵上的驗證
            2.2 酶切檢測結(jié)果
        3 討論
        4 結(jié)論
全文結(jié)論
創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介
附件



本文編號：3869349