發(fā)布時間：2023-11-18 09:58

　　腸毒素大腸桿菌(ETEC)是一種重要的腹瀉致病菌,在發(fā)展中國家嬰幼兒及到這些國家的旅游者的腹瀉疾病中尤為多見。傳統(tǒng)臨床防治中隨著菌株耐藥性增強,抗生素的使用效果愈不如人意,而外源提供特異性卵黃抗體具有安全、無抗藥性、制備簡便等優(yōu)點,成為一種具有廣闊應用前景的抗生素替代品。另一方面在ETEC感染過程中,粘附是致病的首要條件,如何阻斷粘附進而防止腹瀉的發(fā)生是近年來研究的熱點。近期研究發(fā)現(xiàn)兩類非菌毛粘附素即鞭毛蛋白FliC和介導FliC與上皮細胞粘附的EtpA,兩者在人源ETEC粘附上皮過程中起重要作用,并且這種新的粘附機制具有一定的普遍性。本研究利用構(gòu)建的原核表達載體,得到FliC與EtpA蛋白,并在免疫蛋雞后獲得特異性卵黃抗體,并對卵黃抗體體外特性進行研究,通過建立小鼠腸道定植模型,驗證IgY的抗粘附效果。旨在為今后廣譜性抗ETEC腹瀉卵黃抗體的開發(fā)與應用奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下:1.以人源腸毒素大腸桿菌標準株H10407為試驗材料,將PCR擴增后的目的片段連接至表達載體,成功構(gòu)建了在細菌粘附上皮細胞過程中的關(guān)鍵基因etp4和鞭毛基因fliC以及二者融合基因的重組表達質(zhì)粒,其中融合基因之間以一...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
文獻綜述
    1 前言
    2 腸毒素大腸桿菌腹瀉及其防治
        2.1 腸毒素大腸桿菌生物學特性
        2.2 腸毒素大腸桿菌腹瀉的流行病學
        2.3 腸毒素大腸桿菌致病機理
            2.3.1 菌毛粘附素(Fimbrial adhesins)
            2.3.2 非菌毛粘附素(Non-fimbrial adhesins)
            2.3.3 腸毒素
        2.4 腸毒素大腸桿菌腹瀉的防治
            2.4.1 腸毒素大腸桿菌的臨床癥狀與鑒定
            2.4.2 防治ETEC腹瀉的疫苗研究進展
            2.4.3 臨床治療
    3 卵黃抗體的研究進展
        3.1 發(fā)現(xiàn)和發(fā)展
        3.2 分子結(jié)構(gòu)
        3.3 生物化學性質(zhì)
            3.3.1 理化性質(zhì)
            3.3.2 卵黃抗體的穩(wěn)定性
            3.3.2 卵黃抗體在應用上的優(yōu)點
        3.4 分離純化方法
        3.5 IgY應用的研究進展
            3.5.1 IgY在動物疾病上的研究進展
            3.5.2 IgY在人類食品和醫(yī)學中的應用
        3.6 制備IgY免疫原的選擇
    4 研究目的和意義
試驗一 腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白和EtpA的克隆表達
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2 主要儀器設(shè)備
        2.3 主要試劑和試劑盒
        2.4 溶液配制
            2.4.1 細菌DNA提取相關(guān)溶液
            2.4.2 培養(yǎng)基
            2.4.3 DNA凝膠電泳相關(guān)溶液
            2.4.4 SDS-PAGE電泳相關(guān)溶液
            2.4.5 包涵體純化相關(guān)試劑
        2.5 實驗方法
            2.5.1 細菌DNA的提取
            2.5.2 引物設(shè)計
            2.5.3 PCR擴增目的基因
            2.5.4 PCR產(chǎn)物檢測與回收
            2.5.5 DNA片段的克隆
            2.5.6 構(gòu)建表達質(zhì)粒
            2.5.7 誘導表達
            2.5.8 SDS-PAGE檢測蛋白
            2.5.9 包涵體復性
    3 結(jié)果與分析
        3.1 PCR擴增目的片段
        3.2 構(gòu)建目的片段表達載體
        3.3 蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化
            3.3.1 目的蛋白的誘導表達
            3.3.2 目的蛋白的可溶性分析
            3.3.3 目的蛋白誘導表達條件優(yōu)化
        3.4 包涵體的提取
    4 討論
        4.1 表達載體的選擇
        4.2 基因序列對蛋白表達的影響
        4.3 誘導條件對蛋白表達的影響
    5 小結(jié)
試驗二 卵黃抗體的制備與穩(wěn)定性研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗動物
        2.2 主要儀器設(shè)備
        2.3 試劑
        2.4 溶液配制
            2.4.1 免疫蛋雞相關(guān)試劑
            2.4.2 ELISA相關(guān)試劑
            2.4.3 western-blot相關(guān)試劑
        2.5 試驗方法
            2.5.1 蛋白油乳苗的制備
            2.5.2 免疫蛋雞
            2.5.3 間接ELISA測定卵黃抗體效價
            2.5.4 western-blot檢測蛋白免疫原性
            2.5.5 卵黃抗體的純化
            2.5.6 制備噴霧干燥全蛋粉
            2.5.7 卵黃抗體的熱穩(wěn)定性研究
            2.5.8 卵黃抗體的酸穩(wěn)定性研究
            2.5.9 卵黃抗體的酶解穩(wěn)定性研究
    3 結(jié)果與分析
        3.1 最佳抗原包被濃度的確定
        3.2 卵黃抗體效價隨時間的變化規(guī)律
        3.3 抗融合蛋白卵黃抗體的效價鑒定
        3.4 卵黃抗體的凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定分析
        3.5 Western-Blot鑒定卵黃抗體的特異性
        3.6 IgY穩(wěn)定性研究
            3.6.1 熱穩(wěn)定性
            3.6.2 酸穩(wěn)定性
            3.6.3 酶解穩(wěn)定性
    4 討論
        4.1 卵黃抗體的提純
        4.2 卵黃抗體在蛋雞體內(nèi)產(chǎn)生和發(fā)展規(guī)律
        4.3 IgY的穩(wěn)定性研究
    5 小結(jié)
試驗三 卵黃抗體的抗粘附效果研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 試驗動物
        2.2 菌株
        2.3 試驗材料
        2.5 方法
            2.5.1 小鼠攻毒試驗
            2.5.2 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
    4 討論
    5 小結(jié)
結(jié)語
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點
    3 本研究不足之處
參考文獻
致謝



本文編號：3865061